【原创】核酸定量检测
丁香园
2108
核酸定量检测
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一， 因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / ml 的dsDNA，37μg / ml 的ssDNA， 40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。测试后的吸光值经过上述系数的换算， 从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器， 表现出的吸光值漂移越大。事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。另外， 还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等。在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低， 甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260 / A280的比值， 用于评估样品的纯度， 因为蛋白的吸收峰是280 nm。 纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品的A320一般是 0。
各波长具体含义及相关问题
1．A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。
朗伯－比尔定律：
A 吸光值
I0 入射光强度
I 投射光强度
c 吸光物质的摩尔浓度（mol/L）
d 光通过的液层厚度（cm）
ε 摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）
2．A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液
3．A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
4．A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
5．核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精确的检测结果。水的pH值不稳定，可能导致检测误差。一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收，为了确保准确测量，请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。
6．在DNA样品的测定中，一些平行测定的样品会表现出测定浓度的变化，其可能原因为：①DNA样品的A260 吸光度值是否>0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）；②待测样品是否经过了充分的混匀，这样才能保证测定值的均一；③待测样品中有相当含量的杂质。A260/A280和A260/A230是DNA纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5，A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A280是蛋白质的吸光度。
7．A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。同时需要注意的是A260 的读数也必需大于0.1 才能保证可靠的结果。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一， 因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / ml 的dsDNA，37μg / ml 的ssDNA， 40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。测试后的吸光值经过上述系数的换算， 从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器， 表现出的吸光值漂移越大。事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。另外， 还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等。在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低， 甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260 / A280的比值， 用于评估样品的纯度， 因为蛋白的吸收峰是280 nm。 纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品的A320一般是 0。
各波长具体含义及相关问题
1．A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。
朗伯－比尔定律：
A 吸光值
I0 入射光强度
I 投射光强度
c 吸光物质的摩尔浓度（mol/L）
d 光通过的液层厚度（cm）
ε 摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）
2．A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液
3．A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
4．A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
5．核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精确的检测结果。水的pH值不稳定，可能导致检测误差。一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收，为了确保准确测量，请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。
6．在DNA样品的测定中，一些平行测定的样品会表现出测定浓度的变化，其可能原因为：①DNA样品的A260 吸光度值是否>0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）；②待测样品是否经过了充分的混匀，这样才能保证测定值的均一；③待测样品中有相当含量的杂质。A260/A280和A260/A230是DNA纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5，A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A280是蛋白质的吸光度。
7．A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。同时需要注意的是A260 的读数也必需大于0.1 才能保证可靠的结果。
