免疫荧光染色技术检测各类免疫细胞的数量

互联网2010-12-02

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免疫荧光染色技术检测各类免疫细胞的数量

免疫细胞在各自正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中，其细胞膜表面均表达可供鉴别的特殊结构，即表面标志。其中CD分子常作为各类免疫细胞的表面标志用于免疫细胞的鉴定和分离以及用于检测在不同状态下某类免疫细胞数量的变化，能够反映机体免疫功能状态，有助于研究某种疾病的发病机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。

【基本原理】

利用荧光素标记抗人T细胞亚群的单克隆抗体（mAb）直接与人淋巴细胞反应；或用标记有荧光素的羊（或兔）抗鼠IgG作为第二抗体，再借助mAb的介导与人淋巴细胞结合。

在荧光显微镜下，结合有荧光素标记抗体的细胞在黑暗背景下发出荧光，凡是呈现特异性荧光的细胞即为阳性细胞，计数阳性细胞，从而确定T细胞各亚群的百分率。上述方法分别称为直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。

【试剂及材料】

（1）肝素钠溶液:浓度为125～250U/ml。

（2）抗CD3、CD4、CD8的mAb

（3）Hanks液和RPMI-1640营养液

（4）FITC-兔或羊抗鼠IgG

（5）荧光显微镜

【操作方法】

（1）取肝素抗凝外周血2～5ml，常规方法分离单个核细胞，调整细胞浓度至1.5×106 /ml；

（2）将淋巴细胞悬液分别加入20孔PVC软板孔内，每孔100μl，每份标本加4孔。将塑料软板置吊篮中，水平离心1000r/min，1min，去上清；

（3）在1～3孔内分别加入抗 CD3、CD4、CD8的mAb各20μl，第4孔加入1640营养液或无关抗体作为阴性对照；

（4）将微量软板置振荡器上振荡5s，使淋巴细胞与mAb充分混匀。放入有盖湿盒内，置4℃ 冰箱中作用45min；

（5）取出，每孔加入Hanks液200μl，振荡5s，置吊篮中1000r/min离心1min。甩去上清，振荡5s，加Hanks液200μl，重复洗涤3次；

（6）分别加入兔抗鼠IgG荧光抗体各10μl，振荡5s，放入湿盒内置4 ℃作用45min后，同（4）洗涤3次；

（7）甩去上清，加入20％甘油PBS缓冲液50～100μl振荡混匀后，用微量吸液器分别吸取细胞悬液滴至载玻片上，覆以盖玻片。

【结果观察】

在荧光显微镜下用高倍镜观察，分别计数200个淋巴细胞，记录荧光阳性细胞数（细胞膜上呈现明亮点状或帽状黄绿色荧光的细胞），然后分别计算出各淋巴细胞亚群的百分率。