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红细胞花环法检测各类免疫细胞的数量

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红细胞花环法检测各类免疫细胞的数量
【基本原理】
采用戊二醛交联技术将McAb或兔抗鼠IgG与羊红细胞(SRBC)结合,制成致敏的SRBC。抗体致敏的SRBC可与T淋巴细胞直接或间接结合,在T淋巴细胞周围形成花环。通过计数花环形成率,从而确定T淋巴细胞各亚群。该方法可分为直接红细胞花环法和间接红细胞花环法。现以间接花环法为例。
【试剂及材料】
(1) 醛化二抗致敏的SRBC
(2) May-Gruenwald和Giemsa染液。
【操作方法】
(1) 根据待测样品数,取一定量的致敏红细胞悬液,离心去上清,用含20%新生小牛血清(NCS)的RPMI-1640液悬浮,恢复至原体积,4 ℃备用;
(2) 用含20%NCS的RPMI-1640液将PBMC配成5×104 /ml。将试管呈20度角斜放,于37 ℃温育45min,吸出非粘附细胞置另一试管中备用。原试管弃去,以免混入粘附细胞;
(3) 将上述淋巴细胞悬液分别加入塑料软板中,每孔25μl,每份标本加4孔,再分别加入抗CD3 、CD4、CD8的McAb 25μl,同时设阴性对照,置4 ℃作用30min;
(4) 取出,用RPMI-1640液洗涤3次,每次1000r/min离心1min,最后弃去上清,每孔加入上述致敏红细胞悬液25μl,混匀,室温下作用10min,500r/min离心10min,继续在室温下作用1 h,然后放4 ℃作用1 h或过夜;
(5) 取出,轻轻悬浮,用May-Gruenwald和Giemsa染液染色。
【结果观察】
高倍镜检查.淋巴细胞周围粘附有3个以上SRBC者即为花环阳性细胞。共计数200个淋巴细胞,计算出花环形成细胞百分率,以确定T细胞各亚群的百分率。
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