微量细胞毒试验检测各类免疫细胞的数量

基本原理

在补体存在的情况下，针对淋巴细胞CD分子的McAb与相应的CD分子结合，可将细胞杀死，其细胞膜失去屏障作用而使伊红染料透入细胞内，使之染呈红色。而无相应CD分子的细胞则不受损伤，因而不着色。计数死亡细胞数，即可判断待检细胞是否具有相应的CD分子，从而确定T细胞的亚群。该方法简便易行，准确性较高。

试剂及材料

（1）新鲜兔补体

（2）5％伊红染料

（3）0.8％戊二醛

（4）其余材料同前。

操作方法

（1）用1640营养液悬浮PBMC，计数后调整细胞浓度至2×106/ml。加入20孔塑料软板中，每孔10μl，每份标本加4孔；

（2）分别加入抗CD3、CD4、CD8的McAb每孔10μl，同时设阴性对照。振荡混匀5s，放湿盒，37℃作用30min

（3）加入新鲜兔补体，每孔40μl，振荡混匀5s，放37℃湿盒内作用60min；

（4）加入5％伊红染料，每孔20μl，室温10min；

（5）加入0.8％戊二醛，每孔30μl，室温静置15min；

结果观察

将孔中液体吸去一部分，余下的混匀后，滴入白细胞计数池内，在显微镜下观察.死亡细胞呈暗红色，无折光性，体积变大；活细胞则不着色，折光性强，体积大小正常。计数白细胞池4个大方格内全部淋巴细胞，按下式计算出死亡细胞百分率：

死亡细胞％=(实验组死亡细胞数-阴性对照组自然死亡细胞数)/4个大方格内淋巴细胞总数×100％

注意事项

（1）使用的兔补体宜新鲜，高活性且对淋巴细胞无天然毒性，使用之前需作补体的天然毒性试验，将毒性大的兔血清补体弃去。采集的补体要求将20只以上的兔血清混合，小量分装，-20℃低温保存。

（2）分离的淋巴细胞要新鲜，放置时间不应超过12h，否则淋巴细胞活力降低或自然死亡，影响结果。