免疫酶染色技术（ABC法）检测各类免疫细胞的数量

抗体与相应抗原结合后，形成抗原抗体复合物，然而这种复合物在显微镜下是不可见的，如将特异性抗体与酶结合，再通过适当的底物显色，就可使免疫复合物由不可见而成为可见，从而确定组织细胞是否存在某种抗原。

免疫酶染色技术正是根据此原理用酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记已知抗体（或抗原），然后与组织细胞在一定条件下反应，如果组织细胞中有相应抗原或抗体存在，抗原抗体就相互结合形成复合物，其中的酶分子遇到底物时，能催化底物水解、还原或氧化，产生颜色反应，从而可识别出标本中的抗原。

该方法具有敏感性高，标本可长期保存，而且使用一般光学显微镜就能观察等优点。但有时也存在非特异性染色影响。

基本原理

将亲合素与酶标生物素反应形成复合物（Avidin-Biotin- Peroxidase Complex，ABC），再与生物素化的第二抗体反应，借助与T细胞反应的抗人T细胞亚群的McAb（第一抗体）介导和酶催化底物的作用，从而使阳性组织或细胞着色。

试剂及材料

1. 缓冲甲醛-丙酮固定液（pH6.6）

2. pH7.4 PBS

3. 正常马血清

4. 生物素结合的抗鼠IgG抗体

5. 1%H2 O2 -甲醇溶液：配制后立即使用。

6. 标准ABC试剂盒：其中A试剂为亲合素，B试剂为辣根过氧化物酶结合的生物素。

7. 二氨基联苯胺（DAB）

8. 0.5%硫酸铜；0.15mol/L NaOH溶液

9. 苏木紫溶液

10. 替代水：NaHCO2 8g，无水硫酸镁40g，加自来水4L溶解。

操作方法

1. 用PBS调整PBMC浓度至106 /ml；加100μl淋巴细胞悬液于甩片机孔内，500r/min离心5min，制片；将载有细胞单层的玻片在室温空气中暴露2～3min，稍干即置于缓冲甲醛-丙酮液中，4 ℃固定30s，取出用PBS漂洗后再浸于PBS中；

2. 于每一玻片的细胞单层上加100μl用PBS配制的2%马血清，在湿盒中作用20min，浸于PBS中；

3. 加一抗:将抗CD3、CD4和CD8McAb（用含2%马血清的PBS稀释成一定浓度）100μl分别加在玻片细胞单层上，并设阴性对照。置湿盒中37℃温育45min，然后用PBS浸洗2次，每次5min；

4. 加二抗:将用2%马血清PBS稀释的生物素结合的抗鼠IgG抗体100μl加在单层细胞上，置湿盒37℃温育30min，以PBS浸洗2次，每次5min；

5. 将所有标本浸于1%H2 O2 -甲醇溶液中30min，用PBS浸洗2次，每次5min；

6. ABC染色：取A.B试剂等量混合，在每张玻片的细胞单层上加100μl ABC试剂，置湿盒中温育30min，然后用PBS浸洗2次，每次5min；

7. 加底物显色：用1%H2 O2 PBS配制0.05%DAB溶液，立即加在玻片单层细胞上，作用20min，然后用蒸馏水浸洗2次，每次2min；

8. 用0.5%硫酸铜 0.15mol/L NaOH溶液浸洗玻片5min，再用蒸馏水浸洗5min；

9. 用苏木紫溶液复染1min。用蒸馏水洗去多余的染液后，再用替代水浸洗3min；

10. 再用蒸馏水冲洗；依次用70%、95%、100%乙醇脱水各1min，再浸入二甲苯内1min，然后用盖玻片封片后镜检；

结果观察

在油镜下观察，胞浆呈棕黄色，胞核呈蓝色者为阳性细胞；胞浆和胞核均呈蓝色者为阴性细胞。计数200个淋巴细胞，计算出阳性细胞百分率。

注意事项

1. 制片时细胞浓度要适量，否则玻片上的细胞过多，易造成非特异性背景着色；细胞数过少，则计数困难，影响结果。

2. 在实验过程中，2%马血清及1%H2O2 -甲醇溶液均为阻断内源性过氧化物酶活性及减少非特异性背景着色，不可省略。浸洗步骤要严格执行，否则影响结果。