如何评判荧光定量试剂质量

荧光定量 PCR 试剂对比实验结果 (4 月 22 日 )

地点：中国农科院重大工程楼 107

为检验BioTeke公司实时荧光定量试剂（SYBR GreenⅠ）质量，本次实验分别采用国际知名的ABI公司（ABI Power SYBR Green PCR Master Mix）、TOYOBO公司（Realtime SYBR GreenⅠPCR Master Mix）和BioTeke公司产品进行实时荧光定量PCR分析，实验过程中除了荧光定量试剂Mix不同，其它反应条件（模板、引物和反应体系等）均一致， 所用荧光定量PCR仪型号为ABI7000。

实验材料

小鼠肝脏组织

实验方法

RNA提取：RNApure高纯总RNA提取试剂盒（BioTeke），操作步骤参照说明书。目的基因：小鼠管家基因β–actin。

DNA制备：测定小鼠肝脏总RNA浓度，而后使用Super RT Kit（BioTeke） 制备20μl cDNA。操作参照试剂盒说明书。

二步法荧光定量PCR：

小鼠肝脏组织RNA反转录成cDNA后分别用BioTeke公司试剂、ABI公司试剂和TOYOBO公司试剂同时进行两步法荧光定量PCR扩增结果如图1。

从三家公司试剂的扩增曲线（图1a）可看出，在相同反应情况下BioTeke公司试剂的Ct值最小，TOYOBO公司的Ct值次之，ABI公司试剂的Ct值 最大；另外，不同试剂的荧光信号值，BioTeke公司的最高，TOYOBO公司与ABI公司的大致相当，从这些结果可以说明，BioTeke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit具有较高的扩增效率。

从熔解曲线（图1b）可以看出，ABI公司试剂和TOYOBO公司试剂与BioTeke公司相比熔解曲线峰值较低，也同样反应出扩增效率高低的问题。另外两家公司试剂的熔解曲线峰值重复性较差，反应特异性不好，建议引物重新设计。

实验结论

经过实验对比可看出BioTeke公司的2×SYBR real-time PCR premixture Kit是三家公司中扩增效率最高、特异性最好的，并且比ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix具有更高的扩增效率，更好的特异性。说明，BioTeke公司的试剂质量绝不亚于国际知名公司的产品。