亲和层析法纯化多克隆抗体

【实验原理】

虽然多数情况下不需要将抗体与其他血清蛋白分开，但如果一旦需要，蛋白A亲和层析是一种非常有效的分离方法。蛋白A是从 Staphylococcus aureus 中获得，可与抗体重链的Fc片段相结合。现在已知蛋白A可与多种哺乳动物的IgG相结合也可与某些IgM和IgA相结合。

如果将蛋白A与固相载体相连，例如sepharose CL-4B，这种填料可以成为分离和纯化不同类型，不同亚类抗体或抗体片断的重要工具。

【实验材料】

⒈.实验仪器

蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；离心管；离心机；pH试纸；过滤器；玻璃柱。

⒉.实验试剂

⑴ TBS缓冲溶液：6.06g Tris (50 mM), 8.78g NaCl (150 mM)以及0.5g叠氮化钠(0.05%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH 7.4。

⑵ 中和缓冲溶液：121.2g Tris (1 M), 87.8g NaCl (1.5 M), 0.37g EDTA (1mM)及5g叠氮化钠(0.5%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH8.0。

【实验方法】

⒈ 准备蛋白A sepharose CL-4B亲和柱

通常准备5ml或10 ml蛋白A sepharose CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空约15分钟以除去填料中的气泡，否侧在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。

将蛋白A sepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1 ml/分-2 ml/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。

⒉ 制备抗血清

⒊ 亲和层析

将抗体用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5 ml的速度将抗血清上到柱上,为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。

用已经加入100ul中和缓冲溶液的1.5 ml EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。

在柱中加入10ml,pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至A λ280 nm<0.008。

利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后在2°C~8°C保存。

用含0.05%叠氮化钠的TBS缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在2°C~8°C环境。

【实验结果】

【注意事项】

⒈ 叠氮化钠有毒，应戴手套并小心操作

⒉ 在纯化过程中，预冷的TBS缓冲溶液可减少蛋白质的非特异性结合和微 生物 的代谢。