鉴定已经稳定转染细胞
互联网
3051
feiqi:最近我从别人处拿到一种稳定转染的细胞,他让我用G418稳定细胞系,但是我不知道我所拿到的细胞是否真的稳定转染了我所需要基因,怎么进行鉴定?谢谢!
丁香园网友kevinfong认为:
第一,看看是不是G418抗性的。
第二,采用Western检测你所需的基因是否表达,但必需和内源性的比较,如果这个细胞本身不表达你的目的基因那就不需要比较了。
第三,你也可以提基因组做PCR看目的基因是否整合,这时PCR的产物一般会比内源性的基因片段小很多,除非这个基因没有内含子。复杂的检测方法可以根据一些文献做Southern,按他们的方法可以计算整合基因的拷贝数,具体我没做过,不是很清楚,你可以查一些相关文献,或请教其他战友。
丁香园网友feiqi认为:
用免疫荧光或用RT-PCR是否可以?谢谢!
丁香园网友kevinfong认为:
可以。也可以根据你目的基因的表达和分布来决定用那种方法。如果是膜蛋白的话,就可以用流式简单就可以检测和比较了。如果是胞内蛋白,那么也可以用免疫荧光了,但有时免疫荧光的背景不好控制,而且容易假阳性,这种情况下不好比较。如果你们的免疫荧光方法已经很成熟的话,那就没什么问题了。
RT-PCR可以,但最好做蛋白水平,才能反映目的基因真正表达。