核酸膜免疫---第三部分：共价连接及生产

简单、快速的膜介质核酸检测方法已步入发展轨道，但未来还有很长的路要走。

本文第二部分主要讨论提供给膜介质核酸免疫快速诊断应用（IVD 技术，方法2001年9月，53页）研发者们使用的技术。共价连接作为一类具有化学－可控定量偶联技术而被应用到膜介质核酸检测系统中，在本文总结部分较为详细地介绍共价连接方法。本文结尾部分描述了核酸膜介质快速分析产品生产过程中的一些还没有被解决的问题和挑战。

直接结合 核酸无自身反应性，也就是说在一般条件下核酸不会反应，只有在系统中加入足够能量核酸才被动地与其它基团发生作用。已有报道，在可见光（需加光感剂如亚甲基蓝）和紫外光（无需光感剂）条件下核酸可与蛋白质直接交联。

反应膜 活化膜的制造大受关注。所谓活化膜是指表面可提供直接反应的化学基团的膜介质。无需其它试剂，液体样本可直接结合到活化膜表面，这样体现它的好多优势，特别是应用到微量分析中。用来活化膜介质的化学试剂有多种，具有代表性是类似于叠氮化合物一些物质，它们具有一般的反应共性，然而也存在相似的弊端。

反应膜存在几个问题：

第一个问题是失活。随时间的延长，经化学活化的反应膜会因为表面和空气发生反应而失活。膜活化所用化学试剂活性愈高，失活率愈大。为克服这个问题，制造商现在采用对目标探针特异性反应的低活性化学基团。醛基和胺基间的反应就是个典型例子，其中胺基和醛基的功能性都比较稳定。

另一个问题是非特异性结合。活化膜在应用前必须进行封闭，否则会有额外的样品附着在膜上。封闭步骤需简单、快速、高效。理想的封闭结果是形成一个疏水、无电荷的膜表面，然而通常情况下这很难做到。靶物质和膜结合后也必须进行封闭。

膜表面钝化将引入一个新的化学反应，虽然这些新的化学反应不和核酸分子作用，但它可增加膜表面的电荷及疏水性进而导致非特异性信号的上升。这种非特异性信号的来源既有过多结合的样品也有过多结合的检测物质。

活化剂 鉴于具有自身反应性的固相物体在生产、贮存和运输过程存在诸多问题，反应膜不再作为探针共价结合的膜介质。挑选一种只和探针发生特异性化学反应的支持物很难，这种膜物质须低反应性且活性不易因时间、贮存而丢失。目前市场大多数膜介质其表面带有可反应的胺基或醛基基团。

带有胺基的生物分子可以连接到醛基化的物质表面，这一现象虽然被发现了很多年，然而对于连接到醛基化膜的方法却了解甚少。醛基化膜表面优势在于不需添加其它试剂就可以发生大量的连接反应。这种连接反应可能是通过形成Schiff’s碱完形成的（见图2）。

图2胺基与醛基形成的Schiff’s碱及Schiff’s 碱被还原的结果

关于是否需要对据说形成的Schiff’s碱还原的争论很多。Schiff’s碱虽比较稳定，但在生理条件下此反应是可逆的。为保证得到不可逆的连接反应，应加入温和的还原剂（如硼氢化钠）以减少Schiff’s碱中间体的生成。理论上虽如此，但在正常情况下不需要还原Schiff’s碱，有两种可能解释的原因。一种讲法是，Schiff’s碱连接通过类似于z原则作用形成。

虽然在生理情况下Schiff’s碱合成反应是可逆的，但大多数的Schiff’s碱参与到后面的连接反应，少数逆转反应不影响结果。因此分子仍然可以附着到膜上。另一种假说是基于在聚合反应生产的化合物中几乎没有胺的性状，所以推测Schiff’s碱通过胺基群聚合形成。

而事实上天然核酸的胺基基团因嘌呤或嘧啶环的存在而不起化学反应。因此，任何核酸和膜的连接反应都是由在探针合成中引入胺基（如N6-6-aminohexyl(d)ATP or N6-6-aminohexyl(d) CTP）的末端和醛基结合形成。连接到膜介质表面上的探针一端游离，以便和加入的样本反应。

只要有胺基或巯基的活性基团就可合成一条寡核苷酸链，其中的胺基和巯基又可以和其他活性基团连接，其连接方式有两种，其中一种通过相似的基团的连接，即同源双功能连接（即带有胺基分子和带有胺基分子的结合，或带有巯基分子对带有巯基分子的结合）。

另一种是不同基团间的连接称为异源双功能连接（即带有巯基分子和带有胺基分子的结合，或带有胺基分子对带有巯基分子的连接）。上述两种连接方式在标记探针制备都可用到，同时膜介质表面游离的胺基和巯基基团群可被用于其它类似用途。带有胺基或者巯基基团的膜介质可以从几个厂家购买到，也可通过标准方法活化来获得。

图3胺基和戊二醛同源双功能连接反应图 图中反映出同源双功能连接反应存在的问题，当第二个胺基分子 （R'-NH2）在与戊二醛连接时，未参与到第一连接反应中第一类胺基分子(R-NH2)会与之产生竞争。

传统的结合技术特别是带有胺基基团的分子主要通过同源双功能连接，最常用的连接剂为二醛类如戊二醛（见图3）。目前戊二醛不再作为常规应用试剂，现在同源双功能连接最常用的Syngene公司用以合成核酸并商业化的disuccinimydyl suberate(DSS)或者是p-phenylene diisothiocyanate试剂。

N‘N-o-phenylenedimaleimide用于巯基基团间交连。所有同源双功能连接试剂存在时，探针开始活化，之后再加入第二种材料。

虽然同源双功能连接成功用于标记探针的合成，但因其在双引物合成时存在很多问题固而不能被普及应用。同源双功能连接实质是在分子两端形成相同的反应基团，这就意味着在探针活化开始阶段不可避免探针之间的相互作用。基于上述原因，异源双功能连接连接越来越受欢迎。

巯基应用可选择巯基-交换反应如果一个巯基化探针引入到二硫化膜介质上，即可发生巯基-交换反应，然后探针通过二硫键连接到膜上。巯基化探针与处理膜表面的连接反应证明上述反应。巯基-交换反应快速并可定量，唯一弊端是巯基化探针使用前可能形成引物二聚体。

并且通过阻隔二硫键形成引物二聚体大的试剂都会干扰免疫探针二硫键形成。

许多能用来交联的化学试剂可应用于巯基和胺基异源双功能连接。通常情况下，应用到巯基化核苷连接的常用试剂有NHS、MBS及SPDP.前面提到的巯基吡哚连接中二硫键的大多是SPDP催化形成，然而，二硫键易形成链内连接而不是在探针和链间连接。

目前异源双功能连接倾向采用胺基化寡核苷酸，连接化学试剂多使用sulf－SMCC，因为它比较稳定（见图5）。

图4 二硫化物交换反应在双功能连接中的应用

SPDP最初连接到一个伯胺基团上形成一个二巯基化复合物，然后它可与一个巯基反应置换出氮苯基（一个非常好的游离基团）。

无论使用何种方法（二巯基交换除外），共价连接的实现是内在的一系列反应过程，在这个过程中目的物与膜连接及接下来膜封闭都需要一定时间，一般在30min到几小时不等，这种时间上的差异为自动化及大规模的生产带来困难。

光激活连接化学试剂的引入在一定程度上改善上述情况，因为它可应用于简易的成批量生产工艺。但光激活连接化学试剂非常稀有且价格不菲。