核酸膜免疫---第三部分：共价连接及生产

简单、快速的膜介质核酸检测方法已步入发展轨道，但未来还有很长的路要走。

本文第二部分主要讨论提供给膜介质核酸免疫快速诊断应用（IVD 技术，方法2001年9月，53页）研发者们使用的技术。共价连接作为一类具有化学－可控定量偶联技术而被应用到膜介质核酸检测系统中，在本文总结部分较为详细地介绍共价连接方法。本文结尾部分描述了核酸膜介质快速分析产品生产过程中的一些还没有被解决的问题和挑战。

直接结合 核酸无自身反应性，也就是说在一般条件下核酸不会反应，只有在系统中加入足够能量核酸才被动地与其它基团发生作用。已有报道，在可见光（需加光感剂如亚甲基蓝）和紫外光（无需光感剂）条件下核酸可与蛋白质直接交联。

反应膜 活化膜的制造大受关注。所谓活化膜是指表面可提供直接反应的化学基团的膜介质。无需其它试剂，液体样本可直接结合到活化膜表面，这样体现它的好多优势，特别是应用到微量分析中。用来活化膜介质的化学试剂有多种，具有代表性是类似于叠氮化合物一些物质，它们具有一般的反应共性，然而也存在相似的弊端。

反应膜存在几个问题：

第一个问题是失活。随时间的延长，经化学活化的反应膜会因为表面和空气发生反应而失活。膜活化所用化学试剂活性愈高，失活率愈大。为克服这个问题，制造商现在采用对目标探针特异性反应的低活性化学基团。醛基和胺基间的反应就是个典型例子，其中胺基和醛基的功能性都比较稳定。

另一个问题是非特异性结合。活化膜在应用前必须进行封闭，否则会有额外的样品附着在膜上。封闭步骤需简单、快速、高效。理想的封闭结果是形成一个疏水、无电荷的膜表面，然而通常情况下这很难做到。靶物质和膜结合后也必须进行封闭。

膜表面钝化将引入一个新的化学反应，虽然这些新的化学反应不和核酸分子作用，但它可增加膜表面的电荷及疏水性进而导致非特异性信号的上升。这种非特异性信号的来源既有过多结合的样品也有过多结合的检测物质。

活化剂 鉴于具有自身反应性的固相物体在生产、贮存和运输过程存在诸多问题，反应膜不再作为探针共价结合的膜介质。挑选一种只和探针发生特异性化学反应的支持物很难，这种膜物质须低反应性且活性不易因时间、贮存而丢失。目前市场大多数膜介质其表面带有可反应的胺基或醛基基团。

带有胺基的生物分子可以连接到醛基化的物质表面，这一现象虽然被发现了很多年，然而对于连接到醛基化膜的方法却了解甚少。醛基化膜表面优势在于不需添加其它试剂就可以发生大量的连接反应。这种连接反应可能是通过形成Schiff’s碱完形成的（见图2）。

图2胺基与醛基形成的Schiff’s碱及Schiff’s 碱被还原的结果

关于是否需要对据说形成的Schiff’s碱还原的争论很多。Schiff’s碱虽比较稳定，但在生理条件下此反应是可逆的。为保证得到不可逆的连接反应，应加入温和的还原剂（如硼氢化钠）以减少Schiff’s碱中间体的生成。理论上虽如此，但在正常情况下不需要还原Schiff’s碱，有两种可能解释的原因。一种讲法是，Schiff’s碱连接通过类似于z原则作用形成。

虽然在生理情况下Schiff’s碱合成反应是可逆的，但大多数的Schiff’s碱参与到后面的连接反应，少数逆转反应不影响结果。因此分子仍然可以附着到膜上。另一种假说是基于在聚合反应生产的化合物中几乎没有胺的性状，所以推测Schiff’s碱通过胺基群聚合形成。

而事实上天然核酸的胺基基团因嘌呤或嘧啶环的存在而不起化学反应。因此，任何核酸和膜的连接反应都是由在探针合成中引入胺基（如N6-6-aminohexyl(d)ATP or N6-6-aminohexyl(d) CTP）的末端和醛基结合形成。连接到膜介质表面上的探针一端游离，以便和加入的样本反应。

只要有胺基或巯基的活性基团就可合成一条寡核苷酸链，其中的胺基和巯基又可以和其他活性基团连接，其连接方式有两种，其中一种通过相似的基团的连接，即同源双功能连接（即带有胺基分子和带有胺基分子的结合，或带有巯基分子对带有巯基分子的结合）。

另一种是不同基团间的连接称为异源双功能连接（即带有巯基分子和带有胺基分子的结合，或带有胺基分子对带有巯基分子的连接）。上述两种连接方式在标记探针制备都可用到，同时膜介质表面游离的胺基和巯基基团群可被用于其它类似用途。带有胺基或者巯基基团的膜介质可以从几个厂家购买到，也可通过标准方法活化来获得。

图3胺基和戊二醛同源双功能连接反应图 图中反映出同源双功能连接反应存在的问题，当第二个胺基分子 （R'-NH2）在与戊二醛连接时，未参与到第一连接反应中第一类胺基分子(R-NH2)会与之产生竞争。

传统的结合技术特别是带有胺基基团的分子主要通过同源双功能连接，最常用的连接剂为二醛类如戊二醛（见图3）。目前戊二醛不再作为常规应用试剂，现在同源双功能连接最常用的Syngene公司用以合成核酸并商业化的disuccinimydyl suberate(DSS)或者是p-phenylene diisothiocyanate试剂。

N‘N-o-phenylenedimaleimide用于巯基基团间交连。所有同源双功能连接试剂存在时，探针开始活化，之后再加入第二种材料。

虽然同源双功能连接成功用于标记探针的合成，但因其在双引物合成时存在很多问题固而不能被普及应用。同源双功能连接实质是在分子两端形成相同的反应基团，这就意味着在探针活化开始阶段不可避免探针之间的相互作用。基于上述原因，异源双功能连接连接越来越受欢迎。

巯基应用可选择巯基-交换反应如果一个巯基化探针引入到二硫化膜介质上，即可发生巯基-交换反应，然后探针通过二硫键连接到膜上。巯基化探针与处理膜表面的连接反应证明上述反应。巯基-交换反应快速并可定量，唯一弊端是巯基化探针使用前可能形成引物二聚体。

并且通过阻隔二硫键形成引物二聚体大的试剂都会干扰免疫探针二硫键形成。

许多能用来交联的化学试剂可应用于巯基和胺基异源双功能连接。通常情况下，应用到巯基化核苷连接的常用试剂有NHS、MBS及SPDP.前面提到的巯基吡哚连接中二硫键的大多是SPDP催化形成，然而，二硫键易形成链内连接而不是在探针和链间连接。

目前异源双功能连接倾向采用胺基化寡核苷酸，连接化学试剂多使用sulf－SMCC，因为它比较稳定（见图5）。

图4 二硫化物交换反应在双功能连接中的应用

SPDP最初连接到一个伯胺基团上形成一个二巯基化复合物，然后它可与一个巯基反应置换出氮苯基（一个非常好的游离基团）。

无论使用何种方法（二巯基交换除外），共价连接的实现是内在的一系列反应过程，在这个过程中目的物与膜连接及接下来膜封闭都需要一定时间，一般在30min到几小时不等，这种时间上的差异为自动化及大规模的生产带来困难。

光激活连接化学试剂的引入在一定程度上改善上述情况，因为它可应用于简易的成批量生产工艺。但光激活连接化学试剂非常稀有且价格不菲。

膜系统生产要求

任何大规模生产工艺理想的状况是简单、快速且价格不高，可再生，同时不影响杂交的相互作用。生产工艺必须建立质控，主管生产线的QC或者引入的底物材料不要过于复杂，否则很难通过FDA规程的各项试验检查。

高度活化膜常因钝化作用引起寿命衰减的问题，使得人们更希望用活化的核酸与介质膜结合，而不是采用将膜活化后再与核酸连接的方法。现有化学试剂活化膜的方法就象介质膜自身进行整体改造一样简单，而核酸探针在使用前必须进行修饰，而这些修饰一般在探针合成时或者扩增前的溶液中进行。

目前从蛋白免疫分析产品及还不成熟的核酸分析产品的市场来看，膜介质检验产品是最简单的，因为其结合和染色的材料可被应用于连续的过程。膜介质检验产品比较容易调控，染色剂不仅显示出整个反应的过程，还可以定量。喷雾技术及干燥染色方法因在传统层析检验中而闻名。建立大规模的生产线需要配套的产品设备及过程控制、优化、维修几个方面的大量经验。对这一技术的简化应用或者在适当情况下用于增强表面物理吸附，可显著提高生产效率、降低生产成本。珠介质分析方法的生产过程中也比较简单，它是将核酸是固定到通过尺寸筛选的大珠介质上。

图5 SMCC（含一个伯胺R-NH2）与巯基（R’-SH）之间的双功能连接反应

尽管期望将喷雾技术及干燥染色方法应用到核酸膜介质检测方法中，但是目前对于生产，特别是在分析产品的生产阶段，还没有找到一种成熟的工艺技术可以对生产过程进行控制。

紫外交联试剂加入到一标准连续的生产过程中，通过传统的碱基定向连接方法或者使用一种特殊化学试剂使得核酸的光连接变的相对简单。光源将会随时间衰减，因此，为保证生产设备的全寿命周期内交连的连续性，需要一些光检测仪用于检测和控制光照强度。光强度过弱将会导致连接的不完全，光照过强不仅会导致核酸的过度连接而且会丧失活性。必要的控制仪器的设计比较简单。

目前化学连接是批量生产的方式，膜、核酸及固定试剂是在反应终止前规定时间内被活化。尽管有多种控制方法，在生产环境中批次生产步骤很难判定。生产成本可能会比连续生产方式高很多。生产过程可能会有所改变， 但其初始生产设备的采购成本会相当高。

微型分析仪和珠介质分析仪的批次生产与通常的批次生产有显著不同，珠介质分析仪可以通过共价化学方法低成本、高效率的大批次生产。试验证明，生产规模、所需材料量、批次生产过程易于控制。

微- 微阵检验（Micro- and macroarrays）多是按照批次方式组装，很少按照连续方式组装。因此对共原子价联接的表现没有特殊要求。而且微阵检验是唯一一种可以在介质表面上对逐步组装探针的体系类型。 Affymetrix (Santa Clara, CA) 最先尝试将这项技术应用于实际，在应用过程中， 这项技术被一步步的改进并产生了正确的加工流程，逐渐成熟了起来。高造价和批次生产是微阵检验的独特生产特征。这一过程方法不可用于替换主流的生产、应用过程。

结论

目前市场上已有几家膜介质核酸检测产品，一般是将用固定连接了探针的反应膜片放入PCR产物的溶液中进行检测。尽管与其它一些核酸检测方法比较，膜介质核酸检测技术简单、快速；但和我们常用的试纸法比较，膜介质核酸检测的简单、快速方面还差很远。Xtrana（Broomfield，CO）公司和PBaBio Ltd.（Brisbane，Australia）展示的用于核酸检测的层析测试条，样品也只限于PCR产物。尽管这个测试方法为层析测试形式，但在样品加入前需要进行一些的操作步骤（问题化的），因此在本质上是一个多步骤方法仅适用于专业人员使用。

通过物理或者共价作用，一条相配的核酸探针能比较牢固地结合到膜底物上去，并且能定向使碱基游离，后者可以和后加入的探针相互作用。要制备简单的一步法核酸检测方法，目前必须解决问题集中在样品收集及准备、扩增和相配套的敏感检测技术这几个方面。样品准备、扩增的快速技术很多，但大多数更适用于微型仪器设备而不是膜分析。现有的样品准备系统（如FTA from Whatman, Isocode from Schleicher & Schuell, or micromachined cell filters）和简单完整扩增系统（如flow thermocyclers）均不适用于传统的层析分析。在单一试验或者化验中，介质膜作为检测载体可能更耐用些。当然，或许还有更好技术需要人们进一步的开发。

膜介质核酸分析最主要而又突出的优点是简易又价廉。如果膜介质应用发展到既能达到核酸测试的功能要求又能发挥其本身经济、简易的性能的阶段，它将会有很大的市场前景。但是如果膜介质分析只是作为多步骤操作中一个中间环节，它很可能会被微型设备活微型分析仪所取代，尽管它有价格上的优势。

无论哪种基础技术，它们的共同点是仪器记录数据。一步法核酸检测关键在于克服定量功能的挑战。一旦出现真正定量的膜介质检验，那么一步法核酸检测的问题可能就不会那么令人沮丧了。

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