（一）实验前应明确的问题
1. 选择适当的细胞 接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞 长满时约有105个细胞 。但由于不同细胞 贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞 数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞 数和培养时间，以保证培养终止致细胞 过满。
这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞 数呈的线性关系。否则细胞 数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞 增殖抑制表现的最明显）。
4. 培养时间。200 ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞 来说，很难维持68 h，如果营养不够的话，细胞 会由增殖期渐渐趋向 g0期而趋于静止，影响结果，我们是在48 h换液的。
5. MTT法只能测定细胞 相对数和相对活力，不能测定细胞 绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞 、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8. 避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞 时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
（二）实验步骤
贴壁细胞 ：
1. 收集对数期细胞 ，调整细胞 悬液浓度，每孔加入100 ul,铺板使待测细胞 调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2. 5%CO2，37 ℃孵育，至细胞 单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞 贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药. 一般5-7个梯度,每孔100 ul,设3-5个复孔. 建议设5个，否则难以反应真实情况
3. 5%CO2，37 ℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4. 每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ ml，即0. 5%MTT），继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6. 每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。
7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞 、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
悬浮细胞 ：
1）收集对数期细胞 ，调节细胞 悬液浓度1×106/ ml，按次序将
①补足的1640（无血清）培养基40 ul ；
②加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培养液稀释 l g/ ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；
③需检测物10 ul；
④细胞 悬液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100(储存液100 1640）。
2）置37 ℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ ml，即0. 5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞 推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光值）
4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光值。
5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞 、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
（三）MTT的配制
MTT一般最好现用现配，过滤后4 ℃避光保存两周内有效，或配制成5 mg/ ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套. 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60 ℃水浴助溶。
PBS配方:Nacl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，调ph 7.4，定容1 L。
（四）关于细胞 的接种(铺板)
细胞 过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞 密度在10000/ ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞 抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞 的杀伤不会很明显，太密细胞 可能都会凋亡，因为细胞 长的太快营养会不够，最后导致死亡。
且而细胞 过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞 密度多采用10000/ ml，100 ul/孔。
细胞 密度要根据不同细胞 的特点来定. 如果你做的药品对细胞 具有刺激作用那么取小点的细胞 浓度，如果你做的药品对细胞 具有抑制作用那么取大点的细胞 浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞 每孔的细胞 数可达到105,贴壁细胞 可为103-104.
其它的声音：
1. 首先细胞 的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞 。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。
2. MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
3. 我做的是肿瘤细胞 的MTT实验,这种细胞 长的很快一开始我是用100000/ ml的浓度来接种的,结果细胞 长的太满结果是没有梯度也没有线性关系. 后来调整浓度,用过40000~80000/ ml的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ ml的浓度组的.
用40000/M的浓度的组,由于细胞 少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系. 还有根据细胞 生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时.
注意细胞 悬液一定要混匀，已避免细胞 沉淀下来，导致每孔中的细胞 数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞 活力。所以要熟练鞋、快些上板。
首先说说我的一点经验：
1. 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。10 ml的离心管里面最好装3~4 ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞 悬液。。。
2. 吸管的吸液量最好在1 ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量1 ml多的吸管，总液量在5 ml左右为益
3. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。
4. 吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞 前吹打30－50次基本就差不多均匀了。加细胞 的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞 悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）
5. 向每孔中用枪头加入细胞 时不要太快，否则你会发现细胞 在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞 的生长。所以速度不能太快也不能太慢。
我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞 能分散的均匀些。（铺板技术是MTT实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞 ，最后细胞 全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞 。
（五）加入MTT
个人认为MTT最关键的是你的细胞 数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具体细胞 数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些
MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10 ul即够了。如果不使用96孔板，培养基超过100 ul，MTT按照10%的比例加入. 加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀，不过这个应该关系不大。
如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性大,另外MTT稀後加入胞前是需要以的方式菌宜. 且在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的
因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加MTT即可。
