免疫PCR系列三-基本实验步骤

主要程序

（1） 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；

（2） 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；

（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；

（4） PCR扩增生物素化DNA部分。

实验步骤

（1）制备生物素化DNA

将噬粒 BLuescript skt,用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280bp DNa段，即为生物素化DNA。

（2）免疫PCR模式

1. 试剂

包被缓冲液：20mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3；

洗涤液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20；

稀释液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA （0.1mg/ml）。

2.操作

（1） 包被

用包被缓冲液稀释抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃过夜（约15h），用洗涤液洗板3次×5min。

（2） 封闭：

每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80min,洗板数次。

（3） 抗原抗体反应：

用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50μl，室温（22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未结合的抗体分子。

（4） 链亲合一蛋白A结合反应：

每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温（22℃）50min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10min,再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。

（5） PCR

实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明胶（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每种0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。

PCR周期：

PCR前，用紫外线（UV）（254nm）照射上述反应混合物，然后将之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蜡覆盖，按下述温度在PCR仪上进行PCR周期：起始变性94℃5min；30个周期：变性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最后延伸72℃ 5min，得到的PCR产物为特定的261bp的片段。

参考流程

1. 用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度；

2. 加50μl于微孔板内，4℃过夜。同时设阴性对照（加50μl 0.85% NaCl于另一孔内）；

3. 用400μl的0.05% 温20pBS（以下简称TPBS），洗涤五次；

4. 加入2.25%的100μl正常山羊血清（NGS） PBS封闭2小时；

5. 用含0.15% NGS的TPBS洗3次；

6. 加入100μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体（内含100μg的鲜鱼精DNA），室温孵育30min；

7. 用TPBS洗涤五次；

8. 加入50μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体，室温孵育30min；

9. 用TPBS洗涤五次；

10. 加入60μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素，室温孵育30min；

11. 用TPBS洗涤五次，再用HPLC级水洗三次；

12. PCR扩增：加入50μl PCR反应液（内含T3和T7引物），95℃ 60sec，50℃ 110se，72℃ 110sec，循环30次。取PCR产物10μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳，和核酸分子量标准相比较，在相应的位置邮现电泳带为阳性。必需时将电泳结果照像，进行定量分析。