实验动物真菌监测标准操作规程(SOP)

名称：实验动物真菌监测标准操作规程(SOP)

关键词：实验动物真菌监测

目的：规范实验动物真菌监测的具体过程，确保监测结果可靠。

主体内容：

引起实验动物皮肤真菌病的病原菌，主要是石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌和羊毛状小孢子菌三种，这三种菌的检查是实验动物真菌学监测的核心内容。不论是从动物皮肤病灶处，或是从非病灶处分离出这三种菌，均视为异常。因为非病灶处的真菌很可能随后引起实验动物真菌感染，同时对饲养和实验人员构成威胁。

1．检测程序

动物皮毛、鳞屑

↓

沙氏培养基斜面

↓

28℃，7～14d

菌落观察

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涂片镜检

↓

报告结果

2．检测方法

（1）取材：用灭菌刀刮取待检动物可疑病灶或易摩擦部位皮毛、鳞屑少许，并尽快进行分离培养。

（2）直接检查：取标本置于载玻片上，并加氢氧化钾二甲基亚砜液一滴，盖上盖玻片，10～15min后，轻压盖玻片，吸去周围液体，置显微镜下观察。

（3）分离培养：将标本分三点接种于沙氏斜面，放置28℃恒温箱中培养，7～14d观察菌落形态，将培养物涂片镜检。

（4）涂片镜检：取载玻片并加乳酸酚棉蓝染色液一滴，用接种针（环）取培养物置染色液中，然后加盖玻片，镜检。

（5）鉴定：根据菌落形态及镜检结果，参照皮肤病原真菌形态特征，确定菌种。可引起动物皮肤癣病的病原真菌主要有如下三种，它们的形态学特点如下：

①石膏样毛癣菌 （Trichophyton Mentagrophytes）：本菌在培养基上28℃培养，生长迅速。根据菌落形态，大致可分为羊毛状或绒毛状型。白色羊毛状菌丝充满斜面，绒毛状菌落短而整齐，整个菌落只占斜面的1/3～1/2。

培养基背面颜色为淡黄或棕黄色。镜检只见较细的分隔菌丝和卵圆形小分生孢子，小分生孢子集聚成葡萄状，偶见球拍菌丝和结节菌丝等。可见棒状大分生孢子，2～8个细胞，(40～60)μm×(5～9)μm，外壁薄而光滑。

菌种鉴定可依据菌落和镜检特征及其生化特点：如尿素琼脂由黄变红，在1％葡萄糖米粉琼脂上不产生色素等。

②石膏样小孢子菌（Micosporum Gypseum）：本菌在培养基上28℃培养，生长快，菌落初呈白色，渐变为淡黄色至棕黄色粉末状菌落，培养基背面呈棕色。镜检可见很多大分生孢子，4～6隔，(12～13)μm×(40～60)μm大小，呈纺锤型，壁薄、粗糙有刺，菌丝较少，可见少数小分生孢子，单细胞，呈棍棒状，亦可见球拍菌丝、破梳状菌丝、结节状菌丝及厚壁孢子。

菌种鉴定主要依据菌落形态、大分生孢子等，菌落应与石膏样毛癣菌区别。

③羊毛状小孢子菌（Microsporum Lanosum）：本菌在培养基上28℃培养，生长快，菌落开始为绒毛状，2周后呈羊毛状并充满斜面，菌落中央趋向粉末状。菌落颜色由白色渐变为淡棕黄色，反面呈桔黄或红棕色。

镜检可见直的菌丝体，以及很多中央宽大、两端稍尖的纺锤形大分生孢子，大小为(15～20)μm×(60～125)μm，壁厚，表面粗糙有刺，尤其是孢子的尖端部分，多隔，一般4～7隔，偶见12隔。

小分生孢子较小，单细胞，呈棍状，(2.5～3.5)μm×(4～7)μm，可见球拍状菌丝、破梳状菌丝、结节菌丝和厚壁孢子。在米粉培养基上，室温培养菌丝较密，日久变为粉末状菌落，培养基呈棕黄色，镜检可见很多大分生孢子。

（6）结果分析：根据分离培养和镜检的结果，对分离到的真菌进行鉴定，必要时做生化及免疫学试验（如补体结合试验、荧光抗体测定、ELISA测定抗原抗体试验等）。

（7）工作人员的防护：饲养管理和实验人员在与可疑感染真菌的实验动物接触时，必须严格穿戴工作衣帽、口罩、手套，工作完毕用甲醛和高锰酸钾加热消毒空气和器具，以防病原真菌对环境的污染。