实验动物病毒监测标准操作规程(SOP)

名称：实验动物病毒监测标准操作规程(SOP)

关键词：实验动物病毒监测

目的：规范实验动物病毒监测的具体过程，确保监测结果可靠。

主体内容：

实验动物病毒学监测的目的主要有三个：

一为常规定期对所饲养的动物群抽样检查，以了解动物群中病毒感染情况，动物是否符合原来级别；

二为对新引进动物的检疫；

三为动物群中发生某种疾病或发生传染病流行，要确证病原，采取控制措施，并对患病动物进行病毒病原学检查。

病毒检测的方法主要有血清学诊断法、病毒病原学检查法等。

1. 血清学诊断法

在病毒感染时，由于特异抗原刺激动物机体产生相应的体液免疫（特异抗体），因此用已知的病毒抗原检查动物群体的血清中特异抗体的水平和阳性率，从而测出动物群体对这种病毒的感染情况。

（1）血标本的制备：穿刺眼腔静脉或剪断腋下静脉取血，分离血清；或将血按1∶5稀释于含0.5％枸橼酸钠的抗凝剂内，收获上清液作为1∶10稀释的血浆，冻存备用。

（2）检查方法：常规检测的方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫酶试验（IEA）、免疫荧光试验（IFA）、血凝试验（HA）、血凝抑制试验（HAI）、免疫酶组织化学（IH）、放射免疫测定等，视各种病毒对检测方法的敏感性和精确性而选择。血清学诊断法是我国实验动物病毒检测最常用的方法。

2. 病原学检查法

（1）病毒分离培养：适用于动物群中出现的病例，或疾病流行时需要确证病原，或要检出动物群中的潜在病毒。

①标本的采集 选择发病急性期的动物或濒死的动物，在实验室处死，根据动物种属、临床症状和大体病理检查，初步诊断，拟出病毒感染类型，用无菌方法采取脏器、血液、粪、尿、鼻咽分泌物或皮肤病灶等标本，及时处理或放低温（－70℃）暂时保存。死亡过久的动物不宜做病毒分离。如动物现场处理，则应无菌取出标本，置于营养液内保存，立即送到实验室。

②选择培养物 鸡胚或敏感动物是病毒分离的重要环节，根据可能感染的病毒来选择，并尽快接种。

接种细胞：标本接种细胞培养物后，连续培养传代，观察细胞病变的出现或用免疫荧光、免疫酶等方法以证明病毒的存在。例如：鼠痘病毒、鼠肝炎病毒等，可做血吸附试验，若血吸附阳性，证明有病毒存在；仙台病毒，可用免疫荧光或免疫酶试验检查病毒抗原在细胞培养物上的存在；淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒，细胞培养物连续三次传代未发现病毒的迹象为阴性，如有病毒可做进一步鉴定。

接种鸡胚：仙台病毒接种鸡胚尿囊腔后，尿液可检出仙台病毒血凝素，痘病毒接种鸡胚绒毛尿囊膜，有痘斑出现。

接种敏感动物：有些病毒缺乏敏感的组织培养细胞，但接种动物敏感，可选择对该病毒敏感的动物和敏感的接种途径，接种后观察动物的发病情况、抗体产生、病理改变等，并从感染动物再分离病毒或继续传代培养。动物接种时，可用一组已知具有免疫力的动物同时接种作为对照。

③分离病毒的鉴定

用已知阳性血清检查分离的病毒：可做HAI、IFA和IEA等试验。

用电镜观察：用感染病毒的组织培养细胞的超薄切片、浓缩病毒液的负染检查或免疫电镜检查等。

分离的病毒对疾病病原学意义的分析：结合临床症状、病理检查、病毒的检出率进行分析，将分离的病毒感染同类宿主，复制出相似疾病，并用其抗原检查同类急性期病例血清和恢复病例血清的抗体，有４倍或４倍以上增长者，即可证实此病毒为本次流行的病原。

（2）病毒颗粒、病毒抗原和核酸的检出：用各种方法证明动物机体内或其排泄物中有病毒颗粒或病毒抗原的存在，一般适用于急性病例的检查，可作为快速诊断或其他辅助诊断方法。

①用电镜直接检出组织内或排泄物中的病毒颗粒，发现新的病毒。亦可用已知阳性血清做免疫电镜，检查待检的病毒。

②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检查病毒基因组。例如，腹泻动物粪便内轮状病毒被裂解后，在PAGE中出现11条双股RNA片段，有特征性，可鉴别不同组、型的轮状病毒，本法常被用于腹泻轮状病毒的检查。其他病毒，如呼肠孤Ⅲ型病毒和肠道腺病毒都有不同的电泳型。因此，根据有特征性的电泳型便可证明标本内有相应病毒的存在。