基因重组中的关键反应和机制讲解【图文并茂版】

重组DNA 和分子克隆

重组DNA和分子克隆的几种方法：

(依目的基因的来源)

1. 从基因组中分离目的基因在细胞中克隆

2. 由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆

3. 化学合成目的基因进行克隆

4. PCR体外扩增目的片段进行克隆

从基因组中分离目的基因在细胞中克隆

筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆(cell clone)

筛查含有目的基因的细胞克隆

一、目的基因表达

上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。

重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA，蛋白质。

就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物(蛋白)。

如胰岛素，干扰素;生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。(expression cloning).

目的基因表达

真核细胞的基因在原核细胞 (细菌)中表达

原核细胞中缺乏真核基因表达装置(如，RNA剪接因子等)，因此不能直接表达。通常采用大肠杆菌为宿主。

真核多肽的表达要求：

（1）适当的cDNA(完整的编码序列);

（2）适当的表达载体，提供特定多肽信息;

（3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。

产物特征：

（1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定;

（2）活性受限或无活性。

真核细胞基因在真核细胞中表达

真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。

应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。

产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。

二 、基因文库

基因文库(gene library),应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNA克隆。

构建基因组DNA文库

染色体特异的基因文库 ( chromosome specific library)

cDNA文库(cDNA library)

cDNA文库构建：

特定组织细胞一定发育阶段总mRNA

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