高通量测序中植物样本的制备方法
翰宇
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高通量测序技术已广泛应用于植物研究中，但植物材料中较多的蛋白质、多糖以及酚、脂类等次生代谢物质，提取核酸的难度往往比动物或原核生物样本大，因此如何从植物样本中得到高质量的核酸进行后续的测序，成为在植物高通量测序应用中的首要因素。根据核酸类型，可有如下制备方法可参考：
1. 植物基因组 DNA
主要应用于植物的全基因组测序、重测序等。植物的全基因组测序要求基因组 DNA 量至少在 50~100 μg，可采用经典的 CTAB 抽提方法，配方和步骤如下：
CTAB 裂解液配方：100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%CTAB，5% β-巯基乙醇 (随用随加)，
实验步骤：
(1) 取 1-50 g 新鲜植物材料，于液氮中研成粉。
(2) 将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积 (w/v) 2×CTAB 提取缓冲液，65℃ 保温 10-20 分钟，其间不时摇动。
(3) 加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min 离心 10-20 分钟。
(4) 将上层水相转入新的离心管中，加入 0.6-1 倍体积的异丙醇，混匀，室温下放置 30 分钟。
(5) 室温下 12000r/min 离心 15 分钟，去上清液, 70% 乙醇漂洗，沉淀晾干，加入适量 TE 缓冲液溶解 DNA，-20℃ 保存备用。
如植物材料富含多糖多酚，用 CTAB 方法抽提得到的 DNA 纯度较差，也可将 CTAB 溶液做改良加高盐沉淀，二可采用商业的基因组 DNA 纯化试剂盒对 DNA 进行纯化，在得到足量的 DNA 同时得到高质量的 DNA，Zymo Research 的试剂盒应用有不错的效果。
重测序要求基因组 DNA 量相对少，可采用试剂盒 QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit，成本相对低的有天根的 Plant Genomic DNA Kit。
2. 植物总 RNA
主要应用于植物的转录组、表达谱和小 RNA 等测序。植物总 RNA 的提取同样可采用 CTAB 方法, 配方和步骤如下：
CTAB 裂解液配方：100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25 mmol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB，2%PVP，10% β-巯基乙醇 (随用随加)。
实验步骤：
(1) 取 1-5 g 新鲜植物材料，于液氮中研成粉。
(2) 将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积 (w/v) 65℃ 预热的 2×CTAB 提取缓冲液，65℃ 保温 10-20 分钟，其间不时摇动。
(3) 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，4℃12000r/min 离心 10-20 分钟。
(4) 将上层水相转入新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，4℃ 12000r/min 离心 10-20 分钟。
(5) 将上层水相转入新的离心管中，加入 2.5 倍体积的预冷的无水乙醇，混匀，-70℃ 放置 60 分钟。
(6) 4℃ 12000r/min 离心 15 分钟，去上清液，70% 乙醇漂洗，沉淀晾干，加入适量 TE 缓冲液溶解 RNA，-20℃ 保存备用。
如植物材料富含多糖多酚，可采用 LiCl 沉淀 RNA，可有效的去除多糖等杂质。也可采用商业的植物 RNA 抽提试剂盒，天根和天恩泽的试剂盒有着不错的抽提效果。需要注意的是 LiCl 沉淀和普通的柱式抽提试剂盒可能会去除相当一部分的小片段 RNA，因此这类的 RNA 抽提方法不适用小 RNA 测序。
以上是上海翰宇与大家分享的有关植物样本抽提核酸的经验，希望对大家有所帮助。上海翰宇生物会以专业的能力和热忱的态度为您提供高通量测序及分析服务，期待与各位科研工作者的合作。
