高通量测序介绍

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。

自从2005年454 Life Sciences公司（2007年该公司被Roche正式收购）推出了454 FLX焦磷酸测序平台（454 FLX pyrosequencing platform）以来，曾推出过3730xl DNA测序仪（3730xl DNA Analyzer）的Applied BioSystem（ABI）这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了两个强有力的竞争对手，一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roche GS FLX sequencer)，另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（Genome Analyzer platform），为此，2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。

这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列。读取长度根据平台不同从25bp到450bp，不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。

能否以有限的成本用一台仪器产生足够数量的序列标记也是另一个需要改善的重要问题。这个问题已经被Roche公司解决了，应用他们的系统，仅花费阅读35bp或者更小片段的成本就能产生比35bp多10倍的序列标记。

一、高通量测序的应用

高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence)。但是也应该看到，由于高通量测序读取长度的限制，使其在对未知基因组进行从头测序(novo sequencing)的应用受到限制，这部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到850 碱基)的协助。但是这并不影响高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。

2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了RNA 深度测序，这项工作展示了深度测序在转录组研究上的两大进展，表达计数和序列分析。

高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)，而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。

在DNA—蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀—深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。

二、高通量测序的原理

Solexa测序原理：边合成边测序

Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ，此种测序法首先是将 DNA 从细胞中提取，然后将其随机打断，并回收 100 － 200bp 大小的片段，再将接头连接到片段上，然后将片段放到测序的玻璃片上，玻璃片上固定的有与接头片段互补的序列，对这些DNA片段进行原位扩增。在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ）的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。

互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。

针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集， CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基（<50bp）。

454测序原理：焦磷酸测序

依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。

Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。

这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。

自从2005年454 Life Sciences公司（2007年该公司被Roche正式收购）推出了454 FLX焦磷酸测序平台（454 FLX pyrosequencing platform）以来，曾推出过3730xl DNA测序仪（3730xl DNA Analyzer）的Applied BioSystem（ABI）这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了两个强有力的竞争对手，一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roche GS FLX sequencer)，另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（Genome Analyzer platform）.

为此，2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。