PCR基因扩增及扩增产物的回收

实验步骤

实验原理

1 PCR体系的准备和PCR扩增的开始

2.5mmol/L dNTP Mixture 4.0uL

10xbuffer Mg 2+ Ex－TaqE ddH 2 O 40uL

primer 4uL

模板DNA 2uL

94 0 C,2’ 94 0 C 1’ 42 0 C 1’ 72 0 C 2’ 72 0 C 10’ I-------30cycles----I

聚合酶 链式反应(Polymerase Chain Reaction)，即PCR技术。

在合适条件下，这种循环不断重复，前一个循环的产物可作为后一循环的模板参与DNA的合成，最终使产物DNA的量按2n方式扩增。

理论上讲经过30次的循环反应，DNA扩增倍数为106-109。

PCR引物的设计至关重要， 3 ’ 端要严格配对，5 ’ 可以引入酶切位点 ，也可以由此控制Tm值和CG的比值。

TaqE有最适温度和反应的活性，要注意它有加尾活性。

循环数超过30个以后，因为产物数量增加和反应物数量的减少，反应速度降低，这时对反映的产率已经没有贡献，反而副产物增多,影响效果。所以， 循环数不应超过30 。

2 PCR产物电泳

0.8 %Agarose（ 1 ×TAE ） 80伏恒压电泳

全部PCR产物上样电泳：

6uL 10xloading

6uL SYBR

marker部分：

10uL marker（含loading buffer）

1uL SYBR

因为PCR产物会有一些副产物，所以要用电泳的方法分离各种PCR产物。这样也能分离TaqE等杂质。

为了分辨PCR产物和PCR副产品，需要跑一个 分子量marker ，我们的产物是1.6kp。

用TAE的原因是高严可以降低Agarose熔点，促进之后的DNA 吸附。

3 PCR产物的回收（玻璃奶吸附法）

1)

紫外灯下切胶，称胶重

SYBR会使DNA部分显出绿色荧光，在紫外灯下辨认绿色荧光，可将胶切下。

2)

每100mg 胶加入300 uL 溶胶液 ，50 o C溶胶

让DNA充分释放到液体中。

3)

将在-20 o C冻存的玻璃奶解冻， 振匀 ！！

玻璃奶为细微的玻璃小颗粒，因酷似奶状而得名。它为悬浊液，而可以起吸附作用的小颗粒会沉降下来，所以，只有摇匀，我们才能渠道足量的玻璃小颗粒，完成分离的过程。

4)

在溶解后的胶液中加入10 uL玻璃奶，吹打均匀，冰浴沉淀10min， 10,000rpm离心1min，去上清。

这是一个类似于 吸附层析 的过程。DNA会特异的吸附于玻璃奶的小颗粒上，而胶不会吸附于其上，故可以起到分离的效果。

高盐能促进吸附。

5)

在离心所得沉淀中加入200 uL稀释浓缩洗胶液（3体积浓缩洗胶液加入7体积无水乙醇即得稀释液），吹打均匀，10,000rpm离心1min，去上清，如此洗两次。

这是一个 洗涤 的过程。

6)

50 0 C干燥。

7)

加入20 uL TE，吹打均匀，60 o C 5-10min 溶解DNA，12,000rpm 2min，收集上清为回收的PCR产物，-20 o C保存。

此步骤是 解析 。

让DNA释放到溶液中，李新的方法可以将DNA纯化。

低盐有利于解吸附。

8)

检测是否含有DNA

取2uLDNA混合0.5uLSYBR，直接到紫外灯下观察，若有绿色荧光，则证明有DNA存在。