酵母表达的多肽不出条带原因

问：我要表达的多肽是4kd大小，该蛋白是一种抗菌肽.我用的载体是pPIC9，是分泌表达的。先简单说下我前期的工作：

首先我用GS115就做了一次电转化后，MD板长了几个克隆，菌落PCR鉴定阳性率约为20%。然后进一步诱导，先挑单菌落于3mlYPD试管（30ml试管)中摇过夜，然后按1:100接种到10mlBMGY中，诱导大约11h，OD值约2.5。

然后置于超净台静止3h，换50mlBMMY培养基继续诱导，每24h补加甲醇至浓度为0.5%。从24d开始取样，连续5天，最后离心取上清。1ml上清TCA浓缩至20ul，然后跑tricine-sds，分离胶、夹层胶和浓缩胶浓度分别为16.5% 10% 4%。已经跑了2个多月的蛋白电泳了，一无所获。

做了一次抑菌活性也没有抑菌圈出现。自己分析可能有以下原因，同时希望有经验的战友给些建议，下次应该从那些方面调整一下，先谢过了！！

1）BMGY诱导期od值应在2-6，但不同的od值可能蛋白表达量也不同吧，正在考虑取3、4、5、6不同值进行摸索，不知有没有必要呢？望大家能给些建议！

2）BMGY和BMMY之间的体积比不是很明白，我筛选的表型是Muts，是不是应该BMMY体积小些，这样诱导的菌体密度大些？一直用1：5的体积即10mlBMGY换到50mlBMMY中，也试过1:2也没有结果。不知道这个是不是一个影响因素呢？

3）为防止换液带来的污染，我一直都是静止换液，即测过BMGY od2.5以后静止3h，不知静止过程od值是否改变了很多？

4）甲醇对表达量的影响，好像甲醇添加范围是0.5-2%。 我是添加甲醇到0.5%，用不用提高一下添加量啊？

5）我用的超低分子量marker，3kd-20kd，电泳能跑出来，说明我的胶浓度没问题吧，但是 GS115对照跑不出来，是因为条带太大没分离出来吗

6）还有怀疑浓缩方法是否得当？是不是不同的蛋白针对不同的浓缩方法？

自己先分析了这么多，试验进行不下去了，还耗掉了这么多时间，实在着急啊 希望大家帮看看找找原因，多谢了！！

答1：1、首先要把pPICZ protocol看仔细了,我记得muts型的好象是BMGY 浓缩5倍到BMMY,而您是稀释.

2、换液不要那么苛刻,有污染都没什么问题的,OD值已经那么高了,有杂菌也长不起来的.

3、甲醇0.5%的浓度够了,要有表达,也该出来.

4、测活方法和Tricine胶都没问题,个人觉得还是您样品处理的问题,样品浓缩倍数越高越好.可以冻干后在溶解浓缩; 您再打孔测活,孔干了再加样,看有无活性,然后再做后面的分析和优化,祝好运!

答2：你好我以前也做酵母表达的，我说说我的看法吧：

1、你的电转效率也太低了吧，才长几个。等你用PCR鉴定出阳性不就只剩下一两个克隆了吗？这样少的克隆数做表达，不出来也是很正常啊。

2、在BMGY里还是让OD值高些，大慨到4-5左右，稀释后让OD值到1左右就可以。

3、另外有其他的run小肽胶的方法，你可以试试，可能分辨率会好一些。

4、你可以不浓缩，用银染看看。

主要是觉得你筛选的克隆太少了。