靶细胞诱导的CTL细胞颗粒酶胞泌作用

基本原理

该法通过抗原（靶细胞）刺激CTL的TCR，从而活化CTL。其特点是，可定量测定CTL-靶细胞特异性的相互作用，这种靶细胞诱导的CTL细胞颗粒酶胞泌作用，也可通过测定效应细胞或靶细胞的表面分子作为辅助指标。

试剂及材料

1. 特异性靶细胞，其表面携带CTL所识别的抗原；

2. 其余材料见操作方法 。

操作方法

1. 于96孔细胞培养板中加入50μl完全培养液配制的2×106 /ml CTL悬液，然后加50μl 2×105 靶细胞悬液，作为试验孔；并设颗粒酶总释放对照孔（50μl CTL+40μl靶细胞+ 10μl 1%Triton X-100）和背景孔（50μl 靶细胞+50μl完全培养液），各孔最终体积为100μl；均设三复孔；

2. 培养板置37℃温育4h；

3. 颗粒酶分析过程按方法1（抗TCR介导的CTL活性酯酶分析法） 。

方法评价与注意事项

1. 生物学研究已经证实，颗粒酶的胞泌作用需要：

①TCR的交联；

②蛋白激酶C的活化；

③Ca2+ 通过CTL胞浆膜Ca2+通道的转位；

④钙调素依赖的酶活化调节；

⑤与骨架蛋白的相互作用。

因此可见，TCR调节的颗粒酶胞泌作用可能反映CTL的功能，据此建立的CTL功能检测方法可免除靶细胞的标记，甚至无需靶细胞参与。此外，该类方法尚可应用于分析和评价T细胞活化的药物性抑制物和刺激物的效应。

2. 包被培养板的抗TCR抗体的量是影响活化CTL颗粒酶胞泌功能的重要因素，因此应预先将TCR单抗作一系列稀释后包被培养板，以选择最大应答的最适抗体浓度。在抗TCR包板之前先用50μl的羊（或兔）抗鼠Ig（20μg/ml）包板，洗后再加抗TCR，可以提高某些对培养板结合力较低的抗TCR单抗在板上的表面密度。

3. 联合应用上述诱导颗粒酶胞泌作用的方法，更能客观地反映CTL的功能活性。在试验中应设立各种对照，以便获得正确的结果。

4. 在各种方法中，细胞悬液必须在2h内与板上包被的抗体结合。经4h培养后，酶分析过程（板的离心、上清液收集等）应在1h内完成；收集的培养上清液（除LDH活性检测外）可置-20℃冻存备检。酶活性的检测应在1h内完成。