双光素酶报告实验 验证靶基因

双荧光素酶报告实验检测灵敏度很跳，酶标仪检测出来的数值就算是重复孔之间差异有时候都是数量级的差别。建议用不一样的实验系统再次验证实验结果。

报告基因检测实验受多种因素影响，因此同批次样品检测值也可能出现浮动。除了引入另一个报告基因作为内参照避免实验条件变化的干扰之外，一般还需设置3个或3个以上复孔。想要得到一个准确的结果，应尽可能减小复孔之间的差异性：

a.细胞裂解后建议离心取上清，保证样本的均一性；

b.保证加样的准确性，移液器需定期校准，确保移液精准；

注：荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏，复孔之间的数值有一定差异是正常的，一般认为在同一个数量级的差异是可以接受的。

1）荧光值过高

荧光值过高可能会超出仪器检测范围，从而检测不到值，一般读数在5-6位之间较好。荧光值过高可通过以下方式尝试解决：

a.减少质粒转染量；

b.细胞样品裂解后，离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。

注：不建议通过减少底物量来降低荧光值，需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平，否则会造成检测结果出现大的偏差。

2）荧光值过低或无荧光值

荧光素酶的表达水平与启动子活性相关，正常表达水平下检测到的荧光值应在105数量级左右，若检测到的荧光值比较低或无荧光值，可从启动子活性、转染效率、检测过程这几方面进行考虑