检测鼠肝肌动蛋白(p―acdn)基因
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(一) 鼠肝DNA的制备
原理
DNA是储存遗传信息的物质，是遗传的物质基础，它与生命的正常活动如种厉遗传、生长发育有密切关系。其结构与功能的研究是当前分子生物学研究的主要内容之一。
核酸广泛存在于生物中，DNA含有生物体的全部遗传信息，在生物组织中以核蛋白(DNP)形式存在。真核生物中，DNA主要存在于细胞核中，核外也有少量，如线粒体DNA，称为核外基因。DNA的分子长度一般随生物由低级进化到高级而增加。人类含2.9×109bp。
无论是研究核酸的结构，还是它的功能，首先需要对核酸进行分离与提纯。分离与提纯核酸最基本的要求是保持核酸的完整性及纯度。
要从生物组织中提取DNA，睱DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中故首先必须粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使DNP释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP)和DNP往往一起被提取，故DNA沉淀中混有RNA。
需用核糖核酸酶(RNase)处理，去除RNA。并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得较为纯净的DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm波长处的光密度之比值测知，一般以O.D260nm/O.D280nm能达到1.8左右为标准。
分离与提纯过程中保持DNA的完整性和纯度存在许多困难，主要原因有：
(1)细胞内存在很高的DNA酶活性，在分离与提纯过程中会造成核酸的降解。
(2)DNA分子很大，分离过程中因化学因素或物理因素使DNA降解，如强酸、强碱、温度过高或机械张力剪切等。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考：双链DNA含量：
O.D260nm×样品稀释倍数×50μg/ml=μg/m1样品。
器材
1.塑料离心管：6
2.刻度离心管：1
3. 滴管：
长： 1 吸酚：氯仿混合液
中： 1 吸乙醇
短(钝口) ： 1吸DNA水溶液
4.细玻棒：1
5.移液管：1
6.微量取样器1
7.手套：1副
8.离心机
9.紫外分光光度计
10.37℃水浴，50℃水浴
11.组织捣碎器
12.电泳仪及电泳槽
试剂
1.裂解缓冲液：
50mmol/l Tris—Hcl pH7.4
20mmol/lEDTA、
0.5%SDS
100mmol/l NaCl
配法：
1mol/l Tris—HCl pH7.4 50ml
20%SDS 25ml
2mol/l NaCl 50ml
0.5mol/l EDTA 40ml
蒸馏水稀释至 1000ml
其中Tris—HclpH7.4维持PH恒定，防止DNA变性和水解。EDTA能络合二价金属离子，当Mg+’被络合后，细胞内释放出来的DNA酶的作用被抑制，以避免DNA的降解，同时金属离于络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解；SDS有使蛋白质变性的作用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。
2.苯酚
重蒸苯酚加入抗氧化剂8—羟喹啉1mg/ml，用1mol/l PH8.0 Tris—HCl洗一次，再用0.1mol/1Tris—Hcl PH8.0洗二次，苯酚PH在7.6—7.8之间。
3.苯酚：氯仿混和液(1：1)
苯酚加上等体积氯仿并用水饱和，混和液分层，上层为水相，下层为有机相且带黄色。
苯酚和气仿都是蛋白质变性剂，苯酚使蛋白质变性的作用强于氯仿，伹氯仿具有较好的
分层作用。
4.无水乙醇
DNA在PH7.4条件下分于带负电，在NaCl存在条件下，DNA盐呈电中性，乙醇将DNA分子周围的水分夺去，DNA失水形成白色絮状沉淀。
5.TE缓冲液
50mmol/l Tris—HCl pH7.0
5mmol/l EDTA
配法：
lmol/l Tris—HCl pH7.4 10ml
0.5mol/l EDTA EDTA
蒸馏水稀释至 1000ml
6.RNase 10mg/ml
配法：
称取RNase溶解在10mmol/l Tris—HCl(PH7.5)和15mmol/L Tris—Hcl(PH7.5)和15mmol/lNacl落液中使之浓度为10mg/ml。100℃加温15分钟，使夹杂的少许DNase失活，然后慢慢冷却，分装于小管中—20C保存。
7.蛋白酶K(10mg/m1)—20℃保存。
蛋白酶K优点——水解能力很强，作用广泛，可与SDS及EDTA合并使用。
8.20% SDS
9.0.5mol/L EDTA
10.12mol/L 高氯酸
操作：
1.取新鲜鼠肝用冰生理盐水洗去血水，用滤纸吸千后，—70C冰箱中保存，用时取出。
2. 1克鼠肝加10ml裂解缓冲液，在组织匀浆器中匀浆约1分钟(2次，每次1/2分钟)
3.取塑料离心管1支加入1/3支匀浆液(若匀浆液太稠，则再加入lmlTE缓冲液)，然后再加入等体积苯酚：氯仿混和液抽提。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，然后离心t0000转/分钟×5分钟，水相吸入另一干净的离心管中，重复抽提二次。
注意：每次水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提二次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见。若界面上变性蛋白质仍较多，可增加抽提次数
4.水相加入一刻度离心管中后，加入2.5倍体积的冰无水乙醇(可用刻度离心管测量体积)。加5mol/LNaGI到终浓度为0.1mol/L，在离心管中轻缓的混匀，此时可见白色絮状沉淀，此即DNA粗制品。
5.用玻棒捞起DNA沉淀，放入小烧杯中，用70%乙醇洗涤沉淀一次，洗涤时动作要轻，防止DNA被切断。
6.沉淀取出放入一干净的塑料离心管中，用lmlTE缓冲液溶解。
7.在lmlDNA溶液中加入10mg/ml的RNA酶20μl，使最终浓度达到200μg/ml，37℃保温30分钟。
8.加入20%SDS25μl，使最终浓度至0.5%；加入0.5mol/l EDTA30μl至20mmol/l；加10mg/ml蛋白酶K20μl，使最终浓度为200μg/ml，50E保温30分钟。
9.加等体积苯酚：氯仿混合液抽提，重复一次，去除蛋白酶K及其它残留的蛋白质，至界面无明显的变性蛋白质为止。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，离心10000转/分钟X5分钟。
10.吸取水相，水相吸至一干净刻度离心管中量出积体，再加入2.5倍体积的冰无水乙醇，加5mol/LNaCl至终浓度为0.1mol/L，混匀后可得较纯的DNA沉淀，再用70%乙醇洗涤沉淀一次。
11. 在一干净的塑料离心管中用0.3—0.5ml缓冲液溶解沉淀，得到提纯的DNA原液。
12.吸取DNA原液100μl，用TE缓冲液稀释至3ml(1:30稀释)，(若DNA原液太浓，取原液50μl，太稀则取原液200u1)。在紫外分光光度计中测定O.D260nm及O.D280nm的读数。计算：O.D260nm/O.D280nm比值，DNA浓度及DNA总量。剩余原液写上标记，留作做PCR实验，
注意事项：
1.为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须
(1)匀浆时应保持低温，匀浆时间应短，勿用玻璃匀浆器。
(2)实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。
(3)酚抽提时勿剧烈振摇。
2.保持DNA活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA变性。
3.苯酚是一种强列的蛋白质变性剂。实验时，应戴手套操作，避免碰到皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛酚的试剂瓶盖好。
4.离心时要注意管于间的重量平衡。管于要对称放置，当离心达到所需速度后再开始计时。
(二)用PCR技术检测β—actin基因
原理：
PCR(PolymeraseChainReaction)译为聚合酶链反应，或体外扩增技术，是1985年美国cetus公司人类遗传部，加利福尼亚大学Los Angeles和Howghes医学院等联合创建的一项生物技术。这项技术被广泛用于检测核苷酸变异和染色体重捧、高效某一基因片断，线粒体和DNA的直接测序以及细菌、病毒、寄生虫所致疾病的诊断，在分于生物学、医学、生物工程、法医学、考古学等许多领域都有重要的实际应用价值。之所以如此，就是因为PCR具有巨大的扩增能力，从一滴血、一根毛发、一个精于、一个细胞便可扩增出足量的特异DNA供分析、诊断与研究。
PCR的原理类似于天然DNA的复制，主要利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物(人工合成的寡核苷酸片断，它与待扩增片断两条链的两端珍NA序列分别互补)之间引发聚合酶反应。
PCR全过程基于一套“三步曲”：(1)DNA模板的变性，在95℃高温附近，模板DNA双链变性形成单链DNA而游离于反应溶液中；(2)与附加引物退火，在降温过程中，加入反应体系中的两种引物将退火至相应互补的DNA链上；(3)引物延伸(扩增步骤)，将反应体系调节到所选用的DNA聚合酶的最适温度(72℃左右)，在4种dNTP存在下，DNA聚合酶延着引物和模板复合物，由5’→3’端延伸，而新合成的引物延伸链则可作为下一轮反应的模板。以上“三步曲”即构成一个循环，如此重复进行，每循环一次，DNA分予数即按指数倍增(2n)，若循环次数n=25，DNA即已比原来扩增了百万倍。
PCR技术原料简单，包括DNA样品.寡核苷酸引物，4种dNTP，合适的缓冲液及耐热的TaqDNA聚合酶，其中酶的活性、样品的浓度及纯度，引物的设计，缓冲体系是否合适，都会影响PCR的结果。对大多数扩增反应而言，标准的PGR反应体系都是合适的：标准PCR一般在50μl或100μl体积中进行。包括：50mM KCl，10mM Tris-HCI，1.5mM MgCl2，100μg/ml明胶，0.25uM的引物，200uMdNTP，25u的Taq酶和DNA样品，为了封闭反应，防止蒸发，一般体系中加入矿物油。扩增反应在DNA热循环仪或温控水浴锅中按设定程序进行，每个具体的PCR反应要想取得最好的结果，应当在标准体系的基础上，反复摸索，以选择最佳反应条件。
器材
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1.DNA扩增仪 2.20μl，200μl微量加样器 3.电泳仪、电泳槽 4. 紫外透射分析仪 试剂： 1.10XPCR缓冲液： 0.1mol/L Tris—Cl (PH8.3)，0.5mol/l kcl 15mmol/1 MgCl2 0.1% 明胶 2.引物：上游引物5'TGATGGTGCGAATGGGTCAGA3’ 下游引物： 3’ACGGTTGGCCTTAGGGTTCAG5’ (p—actin扩增片数为)221bp 3.1.25mmol/l dNTP 4.50%甘油 5.TaqDNA聚合酶(1u/μl) 操作 PCR反应 1.PCR反应体系的建立。 按顺序在0.5ml塑料小试管中加入以下试剂： 10XPCR缓冲液 2.5μl dNTP 4μl 引物 各lμl 待测样品(鼠肝DNA) 3.0μl H20 5.0 甘油 5.0 TagE lμl 在震荡器上将各组份充分混匀，短暂离心后加一滴液体石蜡覆盖于液体表面。 |
将加好样的试管置于DNA扩增仪上，按94℃ 20S，45℃ 20S，72℃40S的条件扩增30个循环。
(三) 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段
原理
在pH8.0—8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同(忽略碱基上的部分电荷，每个核苷酸残基都带二个负电荷)，因此在自由泳动时，各种核酸分于的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分了筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分于大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度(4℃一30℃之间)无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分于量对数及胶浓度成反比，与电场强度(小于5V/cm)成正比。
在核酸胶电泳中最常用的pH=8.3的TBE缓冲液(0.089 mol/LTris—Borate--0.002mol/l EDTA)和TAE缓冲液(0.04moVLTris—Acetate--0.002mol/LEDTA)，也可用pH7.0，0.01mol/L磷酸缓冲液。TBE缓冲液的缓冲能力较强。
在电泳过程中需马指示剂指示核酸迁移情况，常用的指示剂是溴酚蓝(Bromophenol blue，Bb，蓝紫色)和二甲苯蓝(Xylenecyanol，xc，蓝色)。溴酚蓝的结构式见图2—11，分子量很小，仅670，在通常使用的不同浓度胶中电泳时近似于自由电泳，不存在分于筛效应，所以迁移速度基本相伺。二甲苯蓝结构式见图2，分于量仅554.6，在不同浓度胶中迁移速度也基本相同。二甲苯蓝带电荷量与溴酚蓝不同，所以在同一浓度胶中迁移速度比溴酚蓝慢。这两种指示剂在不同浓度胶中迁移速度与一定长度的核酸分子相当，如在5%的聚丙烯酰胺胶中，Bb与Xc的迁移速度分别与65核苷酸和260核苷酸相同，在7—8moVL尿素—5%聚丙烯酰胺中则相当于35和130核苷酸片段。在0.6%、1.0%、2%的琼脂糖胶中，Bb的迁移速度大致与lkb、0.6kb和0.15kb的双链DNA片段相同。因此，按照所耍分离的核酸分子大小，可以根据指示剂迁移情况来决定电泳时间。
电泳样品中除了加指示剂外；为了使加样品能沉入胶孔，还要加入适量蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。
电泳后的核酸要经过染色才能显示出条带。常用染色剂有溴乙锭(Ethidiumbromide，EB)吖啶橙(Acridineorange，Ao)。
荧光染料溴乙锭是扁平分子，结构式见图3。它可以嵌入核酸双链的碱基对之间，当受紫外光激发时，发射590nm的红色荧光。EB—DNA复合物的荧光比EB本身发射的荧光强许多倍，因此一般不必洗去背景就可观察到核骏电泳带。如果背景太深条带不够清晰，可将胶浸泡于lmmol/L MgSO4中1小时或10mmol/L MgCL2中5分钟，使非核酸结合的EB退色。染色一般在电泳结束后进行，将胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10分钟即可。EB见光会分解，染色时应避光。染色与电泳同时进行，只须制胶时将EB加入胶内使浓度达0.5μg/ml，这样可在电泳过程中随时观察核酸迁移情况。EB带正电荷，会中和核酸分于的负电荷，同时由于它的嵌入增加了核酸分于的刚性，所以在含EB的胶内电泳，核酸的迁移速度减慢，如双链线状DNA迁移速度减慢约15%。因此，用胶电泳方法测定核酸分子(片段)大小时，不宜将EB加入胶内，应在电泳后染色。另外，在胶中未结合核酸的EB向负极泳动，会使样品中各条带染色不均匀，故此法也不宜用于根据荧光强度定量检测核酸。
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在琼脂糖凝胶电泳时，用荧光染料溴乙锭染色，可检测到少至lng的DNA。 单链DNA、RNA分子中若有自身配对的双链区也可被EB分子嵌入，但嵌入量少，因而检出灵敏度较低，大于0.lμg。 器材和试剂 1.器材 (1)电泳仪、琼指糖电泳槽。 (2)20μl微量加液器。 (3)透射式紫外分析仪。 2.试剂 (1)50X TAE Tris—HCl 242. 2g与冰乙酸57.1ml加水至1000ml 0.5M EDTA(pH8.0)100ml (2)载样指示液 25mg溴酚兰溶解于100ml40%蔗糠中。 (3)1%溴化乙锭。 |
1000ml lX TAE 加90ml 1%溴化乙锭
1g溴化乙锭加水100ml，充分溶解后，倒入棕色瓶中，避光保存。
操作
1.琼脂糖凝胶板的制备
称取琼脂糖2克，倒入三角烧杯内，加100毫升电泳缓冲液，置沸水浴或微波炉中加热，使其充分溶解。将溶解后的琼脂糖，自然冷却至6012左右，缓缓倒入凝胶形成板上，待胶冷却凝固后，垂直拔出“木梳”即可。
2.预电泳
将制备好的凝胶板浸入电泳槽中，3—5mA/cm预电泳30分钟。
3.上样与电泳
①提取的鼠肝DNA原液10μl。
②PCR反应物10μl。
③标准分子量DNA3μl、加7μlH2O，分别加1/10体积载样指示液，混匀后上样(不要刺破凝胶)。上样完毕，开启电源(5—7mA/cm)电泳30—60分钟。
4.结果观察
戴干手套取出凝胶板，沥去残留在胶上的液体，将疑胶板倒扣在紫外灯上观察结果。DNA片断的荧光强弱由DNA含量决定，而DNA的迁移率则反映了DNA片断的大小。
图中：λ-DNA：50Kb，PGEM一7Zf(+)/HaeⅢDNA：区带为102、142、174、267、289、328、bp等，6、56Kb，4、37Kb，2、32Kb，2、0 3Kb.
注意事项
1.溴化乙锭是致癌物，操作时耍戴防护手套。
2.在紫外灯下观察结果，耍放下防护罩，以免眼睛受紫外辐射损伤。也可用手提式紫外灯照射凝胶进行结果观察，这样安全些。
3.制备凝胶板时，一定要等溶解后的琼脂糖冷却至60℃左右再倒入成形板上，以免该板受热变形。
