检测鼠肝肌动蛋白(p―acdn)基因

(一) 鼠肝DNA的制备

原理

DNA是储存遗传信息的物质，是遗传的物质基础，它与生命的正常活动如种厉遗传、生长发育有密切关系。其结构与功能的研究是当前分子生物学研究的主要内容之一。

核酸广泛存在于生物中，DNA含有生物体的全部遗传信息，在生物组织中以核蛋白(DNP)形式存在。真核生物中，DNA主要存在于细胞核中，核外也有少量，如线粒体DNA，称为核外基因。DNA的分子长度一般随生物由低级进化到高级而增加。人类含2.9×109bp。

无论是研究核酸的结构，还是它的功能，首先需要对核酸进行分离与提纯。分离与提纯核酸最基本的要求是保持核酸的完整性及纯度。

要从生物组织中提取DNA，睱DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中故首先必须粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使DNP释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP)和DNP往往一起被提取，故DNA沉淀中混有RNA。

需用核糖核酸酶(RNase)处理，去除RNA。并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得较为纯净的DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm波长处的光密度之比值测知，一般以O.D260nm/O.D280nm能达到1.8左右为标准。

分离与提纯过程中保持DNA的完整性和纯度存在许多困难，主要原因有：

(1)细胞内存在很高的DNA酶活性，在分离与提纯过程中会造成核酸的降解。

(2)DNA分子很大，分离过程中因化学因素或物理因素使DNA降解，如强酸、强碱、温度过高或机械张力剪切等。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考：双链DNA含量：

O.D260nm×样品稀释倍数×50μg/ml=μg/m1样品。

器材

1.塑料离心管：6

2.刻度离心管：1

3. 滴管：

长： 1 吸酚：氯仿混合液

中： 1 吸乙醇

短(钝口) ： 1吸DNA水溶液

4.细玻棒：1

5.移液管：1

6.微量取样器1

7.手套：1副

8.离心机

9.紫外分光光度计

10.37℃水浴，50℃水浴

11.组织捣碎器

12.电泳仪及电泳槽

试剂

1.裂解缓冲液：

50mmol/l Tris—Hcl pH7.4

20mmol/lEDTA、

0.5%SDS

100mmol/l NaCl