检测鼠肝肌动蛋白(p—acdn)基因

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(一) 鼠肝DNA的制备

原理
DNA是储存遗传信息的物质，是遗传的物质基础，它与生命的正常活动如种厉遗传、生长发育有密切关系。其结构与功能的研究是当前分子 生物学研究的主要内容之一。
核酸广泛存在于生物中，DNA含有生物体的全部遗传信息，在生物组织中以核蛋白(DNP)形式存在。真核生物中，DNA主要存在于细胞核 中，核外也有少量，如线粒体DNA，称为核外基因。DNA的分子长度一般随生物由低级进化到高级而增加。人类基因组含2.9×109bp。
无论是研究核酸的结构，还是它的功能，首先需要对核酸进行分离与提纯。分离与提纯核酸最基本的要求是保持核酸的完整性及纯度。
要从生物组织中提取DNA，睱DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核 中故首先必须粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使DNP释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP)和DNP往往一起被提取，故DNA沉淀中混有RNA。需用核糖核酸酶(RNase)处理，去除RNA。并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得较为纯净的DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm波长处的光密度之比值测知，一般以O.D260nm／O.D280nm能达到1.8左右为标准。
分离与提纯过程中保持DNA的完整性和纯度存在许多困难，主要原因有：
(1)细胞内存在很高的DNA酶活性，在分离与提纯过程中会造成核酸的降解。 ，
(2)DNA分子 很大，分离过程中因化学因素或物理因素使DNA降解，如强酸、强碱、温度过高或机械张力剪切等。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考：双链DNA含量：
O.D260nm×样品稀释倍数×50ug／ml= ug/m1样品。
器材
1．塑料离心管：6
2．刻度离心管：1
3. 滴管：
长： 1 吸酚：氯仿混合液
中： 1 吸乙醇
短(钝口) ： 1吸DNA水溶液
4．细玻棒：1
5．移液管：1
6．微量取样器1
7．手套：1副
8．离心机
9．紫外分光光度计
10．37℃水浴，50℃水浴
11．组织捣碎器
12．电泳仪及电泳槽
试剂
1．裂解缓冲液：
50mmol／l Tris—Hcl pH7.4
20mmol/lEDTA、
0.5％SDS
100mmol/l NaCl
配法：
1mol/l Tris—HCl pH7.4 50ml
20％SDS 25ml
2mol/l NaCl 50ml
0.5mol/l EDTA 40ml
蒸馏水稀释至 1000ml
其中Tris—HclpH7．4维持PH恒定，防止DNA变性和水解。EDTA能络合二价金属离子，当Mg+’被络合后，细胞内释放出来的DNA酶的作用被抑制，以避免DNA的降解，同时金属离于络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解；SDS有使蛋白质变性的作用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。
2．苯酚
重蒸苯酚加入抗氧化剂8—羟喹啉1mg／ml，用1mol/l PH8．0 Tris—HCl洗一次，再用0.1mol／1Tris—Hcl PH8．0洗二次，苯酚PH在7．6—7．8之间。
3．苯酚：氯仿混和液(1：1)
苯酚加上等体积氯仿并用水饱和，混和液分层，上层为水相，下层为有机相且带黄色。
苯酚和气仿都是蛋白质变性剂，苯酚使蛋白质变性的作用强于氯仿，伹氯仿具有较好的
分层作用。
4．无水乙醇
DNA在PH7．4条件下分于带负电，在NaCl存在条件下，DNA盐呈电中性，乙醇将DNA分子周围的水分夺去，DNA失水形成白色絮状沉淀。
5．TE缓冲液
50mmol/l Tris—HCl pH7.0
5mmol/l EDTA
配法：
lmol／l Tris—HCl pH7.4 10ml
0．5mol/l EDTA EDTA
蒸馏水稀释至 1000ml
6．RNase 10mg/ml