基于 P L G A 与 P E G 纳米基因载体的制备

基于 P L G A 与 P E G 纳米基因载体的制备

材料

试剂

琼 脂 糖 凝 胶（1 % )

乙醇

乙 酸 乙 酯

二 氯 甲 烷

磷 钨 酸 染 色 溶 液（2 % )

Picogreen 试 剂 （Molecular Probes， Invitrogen)

质 粒 ： p C M V -(3-gal 载 体（ElimBiopharmaceuticals)

Poloxamer: 具 有 不 同 的 亲 水 -亲 油 比 值（H L B ) ，及 不 同 的 链 段 长 度Piuronic F 68 与 Piuronic L 121 (B A S F ， G e r m a n y )

Poloxamine: 具 有 不 同 的 亲 水 一 亲 油 比 值（H L B ) ，及 不 同 的 链 段 长 度Tetronic 904 -¾ Tetronic 908 (B A S C O M , Belgium)

聚乳酸-聚 乙 二 醇 嵌 段 共 聚 物（P L A -P E G ， Alkermes， Ohio)

聚 乳 酸 -聚 轻 基 乙 酸 共 聚 物（P L G A ， Boehringer Ingelheim)

聚 乙 烯 醇（P V A ) 溶 液（1 % 与 0 . 3 % m /V )

E L I S A 试剂

仪器

琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 设 备 与 E L I S A 用 酶 标 仪

超 声 波 破 碎 仪（Sonifier， Branson, Barcelona, Spain)

荧 光 分 光 光 度 计

透 射 电 子 显 微 镜

真 空 干 燥 箱

粒 度 -表 面 电 位 仪 Zetasizer 3000 H S(MalvernInstruments)

方法

纳米颗粒的制备

1 . 特 定 组 成 的 纳 米 颗 粒 的 制 备PLGA/P E O 衍 生 物 的 共 混 物 纳 米 颗 粒

通 过 溶 剂 置 换 技 术 制 备 。

a• 将 500 邱 的 质 粒 D N A 溶 于 200ul 的 水 相 中 。

b. 将 50m g 的 P L G A 与 50m g P E O 衍 生 物 溶 于 2m l二 氯 甲 烷 中 。

c. 将 步 骤 a 形 成 的 水 相 与 步 骤 b 形 成 的 油 相 混 合 ，涡 旋 ，形 成 油 包 水 的 乳 液 。

d. 向 乳 液 中 加 人 25m l 极 性 溶 剂（如 乙 醇 ) ，使 聚 合 物 以 纳 米 颗 粒 形 式 沉 淀 。

e. 加 入 25m l 水 ，并 让 有 机 溶 剂 充 分 挥 发 。收 集 纳 米 颗 粒 悬 液 。

PLA -P E G 纳 米 颗 粒

可 以 用 上 述 溶 剂 置 换 技 术 制 备 ，也 可 以 用 双 乳 液 技 术 制 备 。

a• 将 2 0 0 ug 的 质 粒 D N A 溶 于 2 ( % 1 的 水 相 中 。

b. 将 4O m g 的 P L A -P E G 溶 于 I.5m l 乙 酸 乙 酯 ：二 氯 甲 烷（I : 1 ) 的 混 合 溶 剂 中 。

c. 步 骤 a 形 成 的 水 相 与 步 骤 b 形 成 的 油 相 混 合 ，超 声 5s。

d• 将 上 述 乳 液 加 人 到 P V A 的 水 溶 液（l % ； n /V ) 中 ，超 声 5s (输 出 功 率 = 1 0 ) ，形成 双 乳 液（水 包 油 -油 包 水 )。

e. 将 上 述 乳 液 在 揽 拌 下 加 人 到 50 ml 0 . 3 % (m /V ) 的 P V A 水 溶 液 中 ，轻 微 搅 拌 ，以 使 纳 米 液 滴 固 化 。

f. 真 空 下 蒸 发 除 去 有 机 溶 剂 。

纳米颗粒的分离

2, 15°C ， 10 〇〇〇g的转速离心让分离纳米颗粒。

这样的条件可以使纳米颗粒最大量的沉淀，而不会使游离的质粒 DNA 沉淀。

3• 用 水 重 悬 纳 米 颗 粒 ，轻 轻 振 动 或 涡 旋 。

竭米颖粒的表征

4• 利 用 粒 度 分 析 仪 测 纳 米 颗 粒 的 粒 径（Zetasizer H S 3000)。

5• 用 Zetasizer H S 3 0 0 0 测 试 电 势 及 分 布 。

6 . 通 过 磷 钨 酸 染 色 溶 液（2 % ) 染 色 ，用 透 射 电 子 显 微 镜 观 察 纳 米 颗 粒 的 大 小 和 形 态 。

7• 采 用 PicoGreen 荧 光 试 剂 ，根 据 试 剂 提 供 商 提 供 的 操 作 方 法 ，用 荧 光 光 度 计 测 量

D N A 的 结 合 效 率（Molecular Probes， Invitrogen) 。

8 . 通 过 1 % 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析 释 放 的 质 粒 D N A 或 从 纳 米 颗 粒 萃 取 的 质 粒 D N A 的结 构 完 整 性 。

体内基因表达

体 内 基 因 表 达 可 以 通 过 检 测 小 鼠 对 编 码 蛋 白 质 的 免 疫 反 应 来 研 究 。

9• 每 隔 15m i n 向 小 鼠（6 〜 9 只）鼻 腔 中 滴 人 IOfJ 悬 浮 的 纳 米 颗 粒（总 量 为 2 5ugC M V -p-gal，每 个 鼻 腔 3 滴 )。

1 0 . 在 预 定 时 间 点 从 小 鼠 尾 静 脉 取 血 ， 4°C , 3000 g 离 心 5m i n ，收 集 血 清 ，一 20°C 储 存 。

1 1. E L IS A 法 测 定 Ig G 与 Ig A 的 水 平 。