DNA测序的注意事项
互联网
4160
1. 测序所用模板DNA的量一般按下表要求加入：由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
| 模板种类/长度 | 模板量 |
| 200 bp（PCR产物） | 16 ng（120 fmol） |
| 3000-5000 bp（超螺旋质粒DNA） | 4 mg（2 pmol） |
| 48 000 bp（λ粘粒DNA） | 1 mg（31 fmol） |
2. 计算与4.5 pmol 相当的引物纳克数可用以下一般公式：
4.5 pmol=1.5 ng×n，其中n为引物碱基数
计算与1 pmol 相当的引物微克数可用以下一般公式：
dsDNA：1 pmol=（6.6×10-4 mg）×n，其中n为模板碱基对数
ssDNA：1 pmol=（3.3×10-4 mg）×n，其中n为模板碱基数
3. 为阻止TaqDNA聚合酶延伸非特异性退火引物，热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。
模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%
95℃2分钟。然后：95℃30秒（变性），42℃30秒（退火），70℃1分钟（延伸）。
模式2：适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃2分钟。然后：95℃30秒（变性），70℃30秒（退火/延伸）。
4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。
5. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水（NANOpureR或Milli-QR的水）或双蒸水可获得较好的效果，如果水中有杂质，则低分子量条带可能无法出现。
6. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和KodakACS试剂级碳酸钠，一般可获得较好的结果。
