DNA测序

一、DNA测序的意义

1. 揭示基因 结构；

2. 染色体上的基因及其基因位点 ；

3. 分离与鉴定 基因。

二、DNA测序方法：

1. 化学法：Maxam-Gilbert化学修饰法

① 基本原理 ：用化学试剂 处理具有末端放射性标记的DNA片段 ，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。

② 基本步骤：
（1）同位素标记DNA片段的5’端；

（2）在特殊位置上通过化学反应随机打断DNA链G,A(some G),T(some C)，C；

（3）形成大小不一的DNA链；

（4）电泳分离DNA链；

（5）根据同位素标记自显影后读出序列。

③ 优点：不存在因DNA序列或结构引起DNA合成问题，能测定用酶学方法不能正常测序的DNA序列。

④ 缺点：需使用剧毒化学试剂。

2. 生化方法：Sanger的双脱氧链终止法

① 基本原理：在DNA的合成过程中加入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因而形成一种全部具有相同5’-引物端和以相应ddNTP残基为3’端的长短不一的一系列混合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中相应碱基的分布提供准确信息，从而读出DNA的序列。

② ddNTP是Sanger双脱氧链终止法测序的关键。

③ 双脱氧链终止法测序的需求：
（1）单链DNA模板；

（2）寡聚核苷酸引物；

（3）DNA聚合酶；

（4）四种dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；

（5）四种ddNTPs（ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP）的一种。

④ 基本步骤：
（1）准备四个单独的DNA合成反应——引物或四种dNTP中的任何一种经同位素标记，四个反应中除基本成分外，分别加入一种ddNTP；

（2）四个DNA合成反应单独上样进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；

（3）曝光；

（4）从底部向上读出序列。

3. DNA测序自动化
① 使用荧光 标记的DNA；

② 毛细管电泳；

③ 激光检测读序。

4. PCR 用于制备测序反应：
① 测序反应实质就是DNA扩增，因而可以用PCR进行测序反应。

② 与典型PCR反应的不同：只用一个引物；需用测序级的DNA聚合酶；DNA模板量高，一般0.5~1.0mg；循环次数多，一般35~40个循环；产物需纯化 干燥。

三、实际工作中如要进行DNA测序，需要准备什么？

1. 克隆你的目的基因或其片段；

2. 鉴定你所得到的含目的基因或片段的重组质粒 ；

3. 将含重组质粒的细菌或质粒送测序公司；

4. 等结果。