DNA测序的基本原理及准备样品时的注意事项

一、测序的基本原理：

测序的基本原理是Sanger末端终止法，在酶的作用下将原本是一条长达数百碱基的片断扩增成数百条片断，彼此间相差一个碱基。用电泳分离这些片断后，再通过测序仪将这些信号转变成峰图，从而最终形成客户所看到的测序序列和测序的峰图。

目前通用的扩增方式是通过PCR的方式进行的起源；其原理简述如下：PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

采用PCR的方式扩增目标片断具有以下优点：

1. 微量的样品也可进行测序反应

2. 操作简便

3. 缩短了测序样品的准备时间。

因此目前所有提供测序服务的公司都是采用PCR扩增目标片断来进行测序的。当然由于测序反应要求较普通PCR远为严格，因此在所用的酶和反应体系方面均进行了特殊处理。

二、测序的样品要求：

测序由于是要进行特殊的PCR反应的，因此对样品的要求与其他试验的要求有所不同分别简述之：

1. 样品的纯度：PCR具有短时间内高效的扩增能力，因此样品的纯度对反应有至关重要的影响。当样品不纯的时候，那些杂质会对实验结果产生干扰。这在PCR产物测序中表现的尤为明显，在测序结果上表现为峰图杂乱，过多的不可识别的碱基。

2. 样品的量：尽管测序反应可以高效的扩增待测得模板，使得测序所需要的模板量大大降低，但是当最低限度的模板量也不能提供的话，会引起测序反应的异常，表现为无反应，峰图弱，或者反应中断等。

3. 样品的形式：这里专指纯化的PCR产物和质粒样品。正常情况下，溶解样品时常用的溶液有以下几种形式：水，Tris 溶液，TE（Tris—EDTA）三种。当采用TE为溶剂的时候由于溶液中的EDTA可以干扰测序反应的进行，因此实验人员在进行测序时需要注意样品的溶解方式。

三、不同样品的要求及简介：

1. 样品的形式：从测序角度来讲最好是由实验者提供菌液的形式，由公司来提取质粒，这样可以保证DNA样品的数量和质量。如果实验者提供的是质粒或者是纯化后的PCR产物，则需要说明其浓度和溶解的方式（原因如上）

2. 不同样品的说明：

（1）PCR产物：若是PCR产物进行测序时，需要实验者同时提供PCR的双向引物各10ul（浓度>5uM/ul），这是因为PCR的引物要求与测序的引物有所不同，因此不能保证一条PCR引物就能够测成功。双向引物可以在一条引物无法测序的情况下，改用另一端的引物测序。这样一来，最好实验者告知公司一下反应的条件，以便测序公司可以及时调整测序反应。（已纯化）浓度 > 50ng/μl、体积> 10 μl；（未纯化）浓度 > 100ng/μl、体积> 30 μl；引物要求：浓度>5uM、体积>10 μl

（2）质粒产物：需要提供明确的质粒名称，大小、浓度以及测序所用的引物名称，如果是自带引物测序（条件同PCR测序），最好也能够标明反应的条件。质粒的大小对于测序也有着一定的影响。样品中，质粒的总量不低于5ug。

（3）菌液：需要明确的标明所用的抗生素类型和培养条件，以便样品能够培养和扩增。