过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物的制备
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试剂及配制
1. HRP和兔(或羊)抗HRP:抗HRP用HRP免疫兔(或羊)获得。
2. 0.075mol/L醋酸钠-0.15 mol/L醋酸铵等量混合液
3. 0.1mol/LHCl和0.01mol/LHCl
4. 饱和硫酸铵溶液
5. 0.01mol/L NaOH
操作方法
1. 取兔(或羊)抗HRP血清5ml,16000r/min离心20min,去沉淀;
2. 于收集的上清中加入HRP(2mg/ml)溶液1ml,室温缓慢搅拌1h,同上离心;
3. 沉淀物用冷生理盐水洗涤3次,弃上清;
4. 于沉淀中加入HRP(2mg/ml)溶液4ml,混匀后,移至小烧杯;
5. 边搅拌边加入0.1mol/LHCl(约10滴),再用0.01mol/LHCl调pH值至2.4左右;
6. 待沉淀完全溶解,溶液变清时,立即加入0.01mol/LNaOH将pH值调回7.4;
7. 同上离心,去沉淀;
8. 于收集的上清中加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠-0.15 mol/L醋酸铵等量混合液,混匀;
9. 在电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液,并继续搅拌10min后,放4℃20min;
10. 同上离心,去上清,再用等量饱和硫酸铵溶液洗涤离心2次;
11. 将沉淀物溶于5ml生理盐水,并装入透析袋;
12. 用ph6.75醋酸盐缓冲液(13.5L生理盐水、1.5L蒸馏水、75ml 1.5 mol/L醋酸钠及75ml 3mol/L醋酸铵) 4℃透析3天,每天换液2次;
13. 同上离心,取上清进行鉴定。然后加等量60%甘油,小量分装,-20℃保存。
注意事项
1. 制备PAP时应预先选择HRP与抗HRP的等价带。
2. 应用抗HRP McAb制备PAP时,方法较为简单。据程明报道,用小鼠抗HRP McAb的腹水,按一定的HRP/IgG摩尔比(以4:1为宜)混合,置37℃水浴2h,即成鼠PAP复合物。而且由于抗HRP McAb与HRP形成的复合物均为可溶性的,因此不必加入过量的酶量。