模拟过氧化物酶的制备、固定与应用
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一．实验目的
学习一种人工合成模拟过氧化物酶的方法，了解柱子型固定酶的原理以及感性认识酶分析法的一些应用。
二．实验原理
过氧化物酶的辅基是血红素。在体外将血红素与牛血清白蛋白结合制备成含血红素的蛋白质分子作为模拟过氧化物酶。在确定血红素与牛血清白蛋白结合后，检测其的过氧化物酶活性。然后将此人工模拟酶固定在载体琼脂糖凝胶（Sepharose 4B）上并装柱，应用于检测样品中痕量过氧化氢的含量，因为过氧化氢的测定不论是在临床生物化学还是在环境化学和
食品工业中都具有重要意义。
血红素是一活性分子，而血清白蛋白具有极强吸附能力，所以两者能结合。由于含有血红素，该结合物就具有过氧化物酶的特性。琼脂糖凝胶在激活后能很好的吸附蛋白质分子从而把蛋白质分子（模拟过氧化物酶）固定。过氧化物酶能极敏感的催化过氧化氢分解从而使邻苯二胺变成有色物质2，3-二氨基吩嗪，反应如下：
产物2，3-二氨基吩嗪在428nm处有光吸收峰，所以能以此反应来测定过氧化物酶的活性和检测过氧化氢的含量。
三．主要 仪器 与试剂
仪器 ： 紫外-可见分光光度计，摇床，水浴锅，天平，布氏漏斗，恒流泵等。
试剂 ： 氯化血红素、牛血清白蛋白，过氧化氢，邻苯二胺，氨水，环氧氯丙烷，Sepharose 4B，1，4-二氧六环等。
四．操作步骤
1．以等摩尔数将牛血清白蛋白与氯化血红素结合
称取3.216g 牛血清白蛋白于少量水中溶解，后加水至约30ml。先用几滴氨水使0.0312g氯化血红素溶解，加少量水搅匀，然后在搅拌中缓慢滴至30℃的牛血清白蛋白溶液中，最后使混合液最终总体积为80ml。其中所含氯化血红素和牛血清白蛋白的最终浓度均为0.6mmol/L。在30℃ 水浴 中20 分钟（以上全班只做两份）。该混合液经吸收光谱测定确认牛血清白蛋白与血红素结合后，稀释4 倍，以稀NaOH或稀HCl调pH 约为9.5。每组取16ml备用。
2．载体Sepharose 4B的活化
将适量的Sepharose 4B于烧结漏斗中（抽气过滤）抽干，称取8g（湿重），以100ml 1mol/LNaCl和100ml 蒸馏 水先后在漏斗上洗涤，抽干后移至小三角瓶内，加入6.5ml 2mol/L NaOH、1.5ml 环氧氯丙烷、15ml 56% 1，4－二氧六环，于40℃的恒温摇床中振摇活化2h后取出，在烧结漏斗中以 蒸馏 水和0.2mol/L，pH9.5 Na 2 CO 3 -NaHCO 3 缓冲液洗涤、抽干。
3．模拟过氧化物酶与载体的连接
将10ml 牛 血清 白蛋白-氯化血红素复合物（其余6ml 用作酶活力和偶联率的测定）与活化的载体Sepharose 4B混合，在40℃摇床上振荡偶联24h 左右，在烧结漏斗中收集滤液，并用少许蒸馏水淋洗一并收集，量体积，用作未结合模拟酶的量的测定，算出偶联率。将偶联复合物用0.2mol/L，pH9.5 Na 2 CO 3 -NaHCO 3 缓冲液浸泡后装柱。用相同缓冲液平衡。
4．模拟酶固定前活力的测定及固定后的应用
固定前酶活力的测定：将2ml 20mmol/L邻苯二胺与定量模拟酶（如可以是5、10、15μl等）混合后，再与1ml 20%过氧化氢混合，即用时间扫描测定反应0.5 或1 分钟时428nm处的吸光度，以O.D 值/分.mg酶来表达酶的活力。
固定装柱后对过氧化氢检出值的测定：将柱子柱面上平衡液放至界面，把3ml 20mmol/L邻苯二胺与含微量过氧化氢（如2μl）的水样品1ml 混合，用恒流泵以0.5ml/min的流速使
样品经过柱子（洗脱液用0.2mol/L，pH9.5 Na 2 CO 3 -NaHCO 3 缓冲液），收集有色过柱液3ml并测428nm 的吸光值，以水代替过氧化氢与邻苯二胺混合过柱作为对照。改变过氧化氢含量重复以上操作，测定出过氧化氢的最低检出值。以过氧化氢含量与OD 值的关系作出标准曲线，也可测定污水或雨水中过氧化氢的含量（注意相同条件才能比较）。
5．载体与模拟酶偶联率的测定
以1 克Sepharose 4B 偶联模拟酶的毫克数表示。测定模拟酶与载体混合前还原态（加少许连二亚硫酸钠使模拟酶还原）模拟酶在577nm 的吸光值（已知模拟酶的量），再测定偶联后未结合的还原态模拟酶在577nm处的吸光值，通过比例法算出未结合模拟酶的数量，从而算出偶联率。
附：主要物质的分子量
牛 血清 白蛋白：66，411
氯化血红素：652
模拟过氧化物酶：67，063
学习一种人工合成模拟过氧化物酶的方法，了解柱子型固定酶的原理以及感性认识酶分析法的一些应用。
二．实验原理
过氧化物酶的辅基是血红素。在体外将血红素与牛血清白蛋白结合制备成含血红素的蛋白质分子作为模拟过氧化物酶。在确定血红素与牛血清白蛋白结合后，检测其的过氧化物酶活性。然后将此人工模拟酶固定在载体琼脂糖凝胶（Sepharose 4B）上并装柱，应用于检测样品中痕量过氧化氢的含量，因为过氧化氢的测定不论是在临床生物化学还是在环境化学和
食品工业中都具有重要意义。
血红素是一活性分子，而血清白蛋白具有极强吸附能力，所以两者能结合。由于含有血红素，该结合物就具有过氧化物酶的特性。琼脂糖凝胶在激活后能很好的吸附蛋白质分子从而把蛋白质分子（模拟过氧化物酶）固定。过氧化物酶能极敏感的催化过氧化氢分解从而使邻苯二胺变成有色物质2，3-二氨基吩嗪，反应如下：
产物2，3-二氨基吩嗪在428nm处有光吸收峰，所以能以此反应来测定过氧化物酶的活性和检测过氧化氢的含量。
三．主要 仪器 与试剂
仪器 ： 紫外-可见分光光度计，摇床，水浴锅，天平，布氏漏斗，恒流泵等。
试剂 ： 氯化血红素、牛血清白蛋白，过氧化氢，邻苯二胺，氨水，环氧氯丙烷，Sepharose 4B，1，4-二氧六环等。
四．操作步骤
1．以等摩尔数将牛血清白蛋白与氯化血红素结合
称取3.216g 牛血清白蛋白于少量水中溶解，后加水至约30ml。先用几滴氨水使0.0312g氯化血红素溶解，加少量水搅匀，然后在搅拌中缓慢滴至30℃的牛血清白蛋白溶液中，最后使混合液最终总体积为80ml。其中所含氯化血红素和牛血清白蛋白的最终浓度均为0.6mmol/L。在30℃ 水浴 中20 分钟（以上全班只做两份）。该混合液经吸收光谱测定确认牛血清白蛋白与血红素结合后，稀释4 倍，以稀NaOH或稀HCl调pH 约为9.5。每组取16ml备用。
2．载体Sepharose 4B的活化
将适量的Sepharose 4B于烧结漏斗中（抽气过滤）抽干，称取8g（湿重），以100ml 1mol/LNaCl和100ml 蒸馏 水先后在漏斗上洗涤，抽干后移至小三角瓶内，加入6.5ml 2mol/L NaOH、1.5ml 环氧氯丙烷、15ml 56% 1，4－二氧六环，于40℃的恒温摇床中振摇活化2h后取出，在烧结漏斗中以 蒸馏 水和0.2mol/L，pH9.5 Na 2 CO 3 -NaHCO 3 缓冲液洗涤、抽干。
3．模拟过氧化物酶与载体的连接
将10ml 牛 血清 白蛋白-氯化血红素复合物（其余6ml 用作酶活力和偶联率的测定）与活化的载体Sepharose 4B混合，在40℃摇床上振荡偶联24h 左右，在烧结漏斗中收集滤液，并用少许蒸馏水淋洗一并收集，量体积，用作未结合模拟酶的量的测定，算出偶联率。将偶联复合物用0.2mol/L，pH9.5 Na 2 CO 3 -NaHCO 3 缓冲液浸泡后装柱。用相同缓冲液平衡。
4．模拟酶固定前活力的测定及固定后的应用
固定前酶活力的测定：将2ml 20mmol/L邻苯二胺与定量模拟酶（如可以是5、10、15μl等）混合后，再与1ml 20%过氧化氢混合，即用时间扫描测定反应0.5 或1 分钟时428nm处的吸光度，以O.D 值/分.mg酶来表达酶的活力。
固定装柱后对过氧化氢检出值的测定：将柱子柱面上平衡液放至界面，把3ml 20mmol/L邻苯二胺与含微量过氧化氢（如2μl）的水样品1ml 混合，用恒流泵以0.5ml/min的流速使
样品经过柱子（洗脱液用0.2mol/L，pH9.5 Na 2 CO 3 -NaHCO 3 缓冲液），收集有色过柱液3ml并测428nm 的吸光值，以水代替过氧化氢与邻苯二胺混合过柱作为对照。改变过氧化氢含量重复以上操作，测定出过氧化氢的最低检出值。以过氧化氢含量与OD 值的关系作出标准曲线，也可测定污水或雨水中过氧化氢的含量（注意相同条件才能比较）。
5．载体与模拟酶偶联率的测定
以1 克Sepharose 4B 偶联模拟酶的毫克数表示。测定模拟酶与载体混合前还原态（加少许连二亚硫酸钠使模拟酶还原）模拟酶在577nm 的吸光值（已知模拟酶的量），再测定偶联后未结合的还原态模拟酶在577nm处的吸光值，通过比例法算出未结合模拟酶的数量，从而算出偶联率。
附：主要物质的分子量
牛 血清 白蛋白：66，411
氯化血红素：652
模拟过氧化物酶：67，063
