生物可降解纳米颗粒的制备及其在基因转染中的应用

生物可降解纳米颗粒的制备及其在基因转染中的应用

材料

试剂

乙 酰 化 牛 血 清 白 蛋 白（A c - B S A ; Sigma-Aldrich)

细 胞 裂 解 试 剂（C C L R ; P r o m e g a ) 或 Triton X -100 ( 1 . 0 ¾ m /V ) 溶 液

待 转 染 细 胞

氯 仿

胎 牛 血 清（F B S )

水（无 菌）

异 丙 醇

萤 光 素 酶 底 物（如 果 利 用 萤 光 素 酶 为 标 记 基 因）（Promega)

细 胞 培 养 基

完 全 培 养 基（根 据 细 胞 系 的 不 同 ，用 R P M I 1 6 4 0 或 其 他 的 培 养 液），含 1 0 %(m /V ) 胎 牛 血 清

R P M I 1 6 4 0 或 其 他 的 无 血 清 的 培 养 液（根 据 细 胞 系 的 不 同 而 选 择）

B C A 蛋 白 质 检 测 试 剂（M i c r o B C A kit, Pierce)

磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S , p H 7. 4)

质 粒 D N A (10m g /m l )

聚 乳 酸 -聚 羟 基 乙 酸 共 聚 物（P L G A ，聚 乳 酸 ：聚 羟 基 乙 酸 = 5 0 : 5 0 , 在 六 氟 异 丙醇 中 特 性 黏 度 为 I.32dl/g ; Birmingham Polymers Inc. ， A l a b a m a )

聚 乙 烯 醇（PVA）（分 子 质 量 30 000〜 70 0 0 0 ; 8 7 % 〜 8 9 % 水 解 度

Tris-EDTA 缓 冲 液（pH 8 . 0 , 灭菌）

仪器

离 心 管（50m l )

冻干机

滤 膜（〇 •22um; Millipore)

玻 璃 管（5m l )

冰浴

37°C 培养箱

Microcentrifuge 离 心 管

2 4 孔 板

恒 温 振 荡 水 浴（37°C )

超声波发生器（X L 2015 sonicator ultrasonic processor ; Misonix Inc.)

紫外分光光度计

真空干燥箱

方法

包 载 质 粒 D N A 的 纳 米 颗 粒 通 过 乳 化 溶 剂 挥 发 法 制 得 ，每 次 可 以 制 备 含 3 0 〜 90m g聚 合 物 的 纳 米 颗 粒 。以 下 介 绍 含 30m g 聚 合 物 的 方 法 。

溶液的制备

1 . 聚 合 物 溶 液 的 制 备 : 搅 拌 下 ，在 5m l 玻 璃 管 中 ，将 30m g P L G A 溶 解 在 I m l 氯 仿 中 ，要 3〜 4 h 将 聚 合 物 完 全 溶 解 。

2 . 制 备 质 粒 D N A 溶 液 ：将 I m g 质 粒 D N A 溶 液（l O m g /m l ) 与 EOOfXlTris-E D T A 缓冲液 混 合 ，在 不 涡 旋 下 加 人 2m g 无 核 酸 酶 的 乙 酰 化 牛 血 清 白 蛋 白 ，轻 敲 试 管 使 BSA溶 解 。

大 约 要 3 h 将 BSA 完 全 溶 解 ，也 可 以 将 D N A 溶 液 与 B SA 在 冰 箱 中 储 存 过 夜 ，以使BSA 完全溶解。

3 . 制 备 2 . 0 % (m /V ) 的 P V A 溶 液 ：搅 拌 下 ，将 0.2 g P V A ( 分 子 质 量 30 0 0 0 〜70 0 0 0 ) 缓 慢 加 入 到 I O m l 冷 的 T r i s - E D T A 缓 冲 液 中 ，大 约 需 要 30m i n 溶 解 P V A 。

在 4°C ， lOOOr/min 离 心 I O m i n , 并 用 0. 22um 无 菌 膜 过 滤 以 除 去 不 溶 的 P V A 。加 人IOul 氯 仿 使 P V A 溶 液 饱 和 。

DNA 的包载

4 . 将 上 述 D N A 溶 液 加 入 到 两 份 各 100ul 的聚合物溶液中 ， 涡 旋 l m i n , 形成油包水乳液。

5 . 在冰水浴中用探针式超声器以 55W 的输出功率将乳液超声处理 2 min。

此处理过程可减小乳液液滴的大小。在超声前用异丙醇将超声波探针清洗干净，将探针置于乳液的中间，并防止在超声时探针与管壁接触。

6• 将 乳 液 分 两 份 加 人 到 含 6m l P V A 的 50m l 离 心 管 中 ，每 次 滴 加 后 涡 旋 l m i n ，形 成 油包 水 -7jC 包 油（water-in-oil-in-water) 的 双 乳 液 ，同 步 骤 5 超 声 5m i n 。

7•室 温 下 ，将 得 到 的 乳 液 在 同 一 个 管 中 缓 慢 搅 拌 过 夜（约 18 h ) ，使 氯 仿 挥 发 。

8 . 为 确 保 氯 仿 挥 发 完 全 ，将 悬 浮 的 纳 米 颗 粒 在 真 空 干 燥 箱 中 搅 拌 继 续 干 燥 l h 。

9.在 4°C ， 110 O O O g 下超速离心 20m i n 收集纳米颗粒，同时收集上清液。

1 0 . 将 纳 米 颗 粒 重 悬 浮 于 5 ml Tris-E D T A 缓 冲 液 中 。首 先 用 缓 冲 液 反 复 冲 洗 纳 米 颗 粒直 到 其 全 部 悬 浮 ，再 同 步 骤 5 在 冰 浴 中 超 声 30s。

1 1 . 重 复 步 骤 9 与 1 0 以 除 去 游 离 的 D N A 和 P V A 。

12• 用 步 骤 9 的 上 清 液 和 步 骤 1 1 的 洗 涤 液 确 定 未 被 包 封 的 D N A 的 量 ，使 用 紫 外 分 光 光度 计 测 试 260n m 的 吸 收 。测 试 中 ，用 制 备 不 含 D N A 的 纳 米 颗 粒 的 步 骤 9 的 上 清 液和 步 骤 1 1 的 洗 涤 液 作 为 参 照 。

13•用 1〜2m l 的无菌水重悬浮纳米颗粒并超声 lm i n。 4°C ， lOOOr/m i n 离心纳米颗粒悬浮 液 I O m i n，以除去可能存在的纳米颗粒聚集体。

14.收 集 悬 浮 液 并 存 放 于 称 量 过 的 离 心 管 中（如 果 有 必 要 可 以 分 成 几 份 ），在 8 0 ° C 下冷 冻 45m i n ，冻 干 2d ，得 到 干 燥 的 固 体 粉 末 。在 4℃下储存冻干的纳米颗粒。

转染方法

15.在 24 孔板中以 3. 5X 10⁴ 个细胞/ ( 孔 . m l ) 的密度接种待转染的细胞，使用完全培养基，平 行 6 孔。以同样的细胞密度，不加纳米颗粒作为对照。

16.细胞在 24 孔板中培养 24 h 。

17.在无菌环境用〇.5 ml R P M I 1640 重悬包载 D N A 的 4m g 纳 米 颗 粒（针对不同细胞，也可使用其他无血清的培养液)。在水浴超声器中超声 l 〇 m in。

1 8 . 用含有 1 0 % F B S 的 R P M I 1640 (或其他适合细胞生长的营养液） 将纳米颗粒悬液稀释至 9m l 。

19.吸去细胞培养板中的营养液，并加 X l m I 上述纳米颗粒悬液。

20•在 37°C ， 5 % C 0 2 条件下培养细胞 24 h 。

21.吸去纳米颗粒悬液，并加人等量的细胞培养液。随后，每隔一天换一次培养液，不再加人纳米颗粒。

22.在合适时间裂解细胞以测量基因表达的水平。

a. 用冷的 P B S 冲洗细胞两次。

b. 在每孔中加入〇 • 1m l I X 细胞裂解液（C C L R ) 或 〇 • 1 % U /V ) Triton X -100 溶液。

c.37 C 将 24 孔板在振荡培养箱中振荡 3 〇 m i n 。

23.检测细胞裂解液中基因表达的水平。如果用董光素酶为标记基因，可以用萤光素酶底物通过化学萤光检测基因表达水平，同时用 B C A 蛋白质定量试剂测定蛋白质含量 ，以每毫克细胞蛋白质归一化昔光素酶的表达水平。