质谱生物分析中的应用

质谱在肽和蛋白分析中的应用

　　质谱已成为肽和蛋白分析的重要工具，主要归功于一些软电离技术的应用，如电喷雾(ESI)和基体辅助激光解吸电离(MALDI)。生物大分子多为极性、难挥发化合物，不易气化，用传统质谱无法测定。但随着新的离子化技术的广泛应用，现已能高效地电离一些完整或片断的大分子生物聚合物，从而进行质谱测定。本文对质谱在肽和蛋白分析的几个领域中的应用进展进行评述。

1　软电离技术

1.1　电喷雾电离(ESI)　电喷雾电离利用位于一根毛细管和质谱仪进口间的电势差生成离子，在电场的作用下产生以喷雾形式存在的带电液滴，当使用干燥气或加热时，溶剂蒸发，液体体积缩小，最终生成去溶剂化离子。电喷雾电离的特征之一是可生成高度带电的离子而不发生碎裂，这样可将质荷比降低到各种不同类型的质量分析仪都能检测的程度。通过检测带电状态，可计算离子的真实分子量。同时，解析分子离子的同位素峰也可确定带电数和分子量，因同位素峰间的质荷比差与带电数相对应(如，2+离子碳同位素峰间质荷比差为0.5)。尽管ESI容许使用少量缓冲液和盐，但这些物质可能与待测物形成加合物，导致产生难以指认的分子量或抑制待测物离子的形成。当样品中不含盐类和缓冲液时检测情况较好。ESI的一大优势是可方便地与分离技术联用，例如在使用ESI离子化前使用HPLC和毛细管电泳(CE)可方便地除去待测物中的杂质。
1.2　基体辅助激光解吸电离(MALDI)　以有紫外吸收的小分子晶体为基体，将待测物与基体相结合，可检测带电生物分子的离子。在所采用的激光波长下，基体对激光有较强吸收，而待测物对激光只有弱吸收。当激光打在基体晶体时，聚集的能量加热晶体，快速加热导致基体晶体升华而将非挥发性待测物释放到气相中。基体在待测物离子化过程中还起着质子化或去质子化试剂的作用。基体引进激光解吸技术前，只有低分子量化合物能被完整引入气相；对于高分子量化合物，则无法解决其气化问题。基体的加入使除待测物—基体外的分子间相互作用减少，降低了解吸能，解决了大分子的气化问题。MALDI可允许使用一般生物缓冲液。MALDI主要生成带单电荷离子，这样质谱图中的离子与混合物中肽和蛋白基本存在对应关系。

2　肽和蛋白分析中的应用

2.1　测序　在鉴定新的肽和蛋白、合成产物及从蛋白质水解液中分离出的肽时，氨基酸序列的信息非常重要。质谱已成为对小量肽和蛋白进行测序的有效工具。Chait等建立了对肽链N-端进行测序的方法，称作蛋白梯形测序(protein laddersequencing)。原理：① 使用少量链终止剂，进行快速分步降解，在人为控制下产生一系列肽段，其中每个肽段于下一个之间只相差一个残基；② 用MALDI-TOF(飞行时间)-MS读出肽段信息。用此方法可在磷酸肽中定位磷酸丝氨酸残基。研究N-端封闭的肽和蛋白，必须了解其C-端序列的信息。物质P、胰高血糖素、血管紧张素、胰岛素B链和肌红蛋白的测序可用肽链端解酶羧肽酶Y和P进行酶解，然后结合MALDI-TOF MS监测C-端蛋白。亮氨酸/异亮氨酸和赖氨酸/谷氨酰氨分子量相同，无法区分。Ramsey等通过负离子质谱跟踪由亮氨酸和异亮氨酸衍生出的乙内酰苯硫脲的［M-H］-离子，建立了区分肽中亮氨酸和异亮氨酸的方法。亮氨酸衍生物谱图主要显示丙基的丢失，而异亮氨酸衍生物则显示丢失甲基和乙基。Patterson等用羧肽酶Y对22种有不同氨基酸位置、大小、电荷和极性的肽进行C-端水解，显示了该技术的普遍适用性。
　　用HCl将肽部分水解后用MALDI-TOF MS分析，可迅速获得与序列有关的肽图。合成的肽在110℃用3 mol.L-1 HCl处理5 min后，氨基酸从C-端和/或N-端释放出，其量足够用于验证肽的指认过程。-20℃时将多肽置全氟酰基酸酐中30～60 min，使分子从C-端顺序发生化学降解。测量C-端被截断的产物混合物的FABMS后，只需计算分子离子间的质量差，就可测出C-端序列。用LC/ESI-MS时，用新的Edman试剂，可将检出限降至nmol范围。Vladimirov等用RP-HPLC从人体胎盘中分离出40S核糖体蛋白。每一色谱组分都用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DPAGE) N-端测序进行鉴别。N-端封闭的蛋白用内蛋白酶赖氨酸-C切割，然后对合适的肽段测序。用此法可对HPLC洗脱出的40S人体核糖体亚单元中所有蛋白进行鉴定。
　　ESI-MS用于短肽链高灵敏度测序，由于技术的困难，该法不能分析从凝胶中离析的蛋白质。Wilm等介绍了一种从PAGE中离析的蛋白质进行测序的简便有效的方法纳克级电喷雾串联质谱法。用此方法低至5 ng的蛋白都可被测序。Wilm等测序并克隆了一种蛋白，它可在体外抑制毛细血管内皮细胞再繁殖，有可能对固形肿瘤产生潜在的抗血管形成作用。酵母蛋白的部分银着色单维凝胶也用纳克级电喷雾串联质谱进行了分析。银着色节省了样品准备时间，它比Coomassie蓝着色法更可取。在反射式MALDI-TOF质谱仪中，对一些小肽用阴、阳肽离子的源后衰减技术(post source decay，PSD)进行了比较，肽的阳离子碎片离子大部分从N-端产生，而阴离子离解主要生成C-端碎片离子。结果表明阴离子和阳离子PSD为肽的初始序列提供了互补信息。用MALDI-TOF MS进行线型肽的碰撞激发解离(CAD)研究，氦、氮、氩或氙注入气体池以获得高能CAD信息。经典的高能CAD串联质谱中得到的典型碎片在这些谱图中同样出现。近年还出现了一种新的方法，它将酶水解、液相色谱分离、串联质谱技术联用并运用计算机算法与数据库中肽的串联质谱数据相对照进行测序。
2.2　蛋白质中胱氨酸和胱氨酸残基的定位　半胱氨酸和胱氨酸(二硫化物)间的氧化还原平衡在特定蛋白的氧化还原活化或在稳定蛋白质三维结构方面都起着重要作用。在蛋白二硫键还原前后进行化学修饰，继以MS分析，可对一个蛋白内的胱氨酸和半胱氨酸的数目进行定量测定。Zaluzec等用对-羟基汞苯(pHMB)进行蛋白硫醇的微量衍生。用pHMB进行半胱氨酸衍生前后MALDI-TOF MS观察到的质量位移可确定自由巯基的数目。巯基的总含量可由二硫化物还原反应和随后的衍生过程确定。有时可观察到以下竞争反应：半胱氨酸与试剂中可能存在的汞离子反应产生变体。若时间足够长，即使低浓度汞离子都可置换有机汞试剂。因此，为了进行肽或蛋白中硫醇的定量衍生，必须在使用pHMB前进行纯化以除去Hg2+。Wu等使用2-硝基-5-硫氰苯甲酸(NTCB)进行化学修饰，测出游离半胱氨酸和胱氨酸基团的数目和位置。在非还原性条件下，此试剂用于选择性地氰基化蛋白中的半胱氨酸硫醇。修饰的半胱氨酸残基的N-端肽键可在碱性条件下用三(2-羧乙酸)盐酸膦切下，以形成一个氨基酸端肽以及一系列2-亚氨基噻唑-4-羧肽，然后用MALDI-TOF MS进行测定。在还原状态下，重复以上实验即可确定半胱氨酸残基总数。Watson等用与此相似的检测半胱氨酸和胱氨酸的方法，pmol级的起始物质与NTCB和三羧乙酸膦反应，再用MALDI-TOF MS分析。Denslow等报道了束缚在PVDF膜上的蛋白的切割过程，用NTCB氰基化半胱氨酸残基后切割，再用MALDI-TOF MS测定所得片段的质量。Ming等对蛋白的巯基进行化学修饰后用MALDI-TOF MS或ESI-MS确定修饰产物的分子量。MS还用于显示蛋白的折叠可能与二硫键的形成有关。Ruoppolo等用MS法研究还原和变性RnaseA(核糖核酸酶)的重折叠过程。此法可鉴别折叠中二硫键的形成和重新排列。研究表明，即使在变性条件下发生再氧化过程，二硫键的形成也不是随机的。Crimmins等用MALDI-TOF MS分析通过二硫键键合的异二肽，得到了二肽及每个单体肽组分的质量；而用ESI-MS进行类似分析只给出二肽的质量。结论是MALDI-TOF MS中的碎裂过程与氨基酸胱氨酸水溶液的光引发均裂有相似之处，提供了一种指认蛋白中二硫键的简便方法。Sun等用FAB-MS、在线的微孔/微柱HPLC/ISI(离子喷雾)MS和MALDI-TOF MS定位蛋白质中二硫键。
2.3　蛋白磷酸化定位　哺乳动物细胞中的蛋白质约三分之一是磷酸化的，质谱逐成为分析蛋白质磷酸化位置的重要工具。Annan和Carr用反射式MALDI-TOF MS对低于pmol的磷酸肽进行了鉴定和测序。对于含有单个磷酸基团的肽，可以区分酪氨酸的磷酸化与丝氨酸和苏氨酸的磷酸化。在正离子MALDI-TOF质谱图中，［MH-H3PO4］+和［MH-HPO3］+碎片离子的存在标志着含有磷酸肽。PSD为有前途的磷酸肽测序技术。Carr等选择性地鉴定和测序了在蛋白质水解液中以fmol级存在于Ser,Thr和Try位置上磷酸化的肽。Huddleston等［24］用HPLC/MS技术，发挥了碰撞诱导电离(CID)的优势，生成磷酸特异标记的离子。将HPLC与ESI-MS在线联用，并用高能CID分析鉴定小鼠蛋白激酶CβII的体内磷酸化位点，可探测出该激酶的一级结构。Watts等在用T细胞受体ζ(TCR)刺激T细胞后，用HPLC-ESIMS鉴定体内酪氨酸在淋巴细胞特异蛋白酪氨酸激酶ZAP-70上的磷酸化位置。为鉴定酪氨酸-磷酸化肽，将一蛋白酪氨酸磷酸酶微反应器与CE或HPLC和ESI-MS联用。将ESI-MS与Edman降解结合可鉴定磷酸半胱氨酸。Howard等建立了新的鉴别蛋白质中丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点的方法。加入b-消去/乙硫醇(b-elimination/ethanethiol)修饰磷酸化蛋白，使磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸残基转变为S-乙基半胱氨酸或b-甲基-S-乙基半胱氨酸残基，将修饰后的蛋白进行水解，水解物用微柱液相色谱，电喷雾串联(MS/MS)离子阱质谱和数据库检索进行分析，确定初始的磷酸化残基。
2.4　糖蛋白、糖肽和糖　质谱在糖蛋白鉴定和分析中有重要作用，在制药工业中尤为重要，因有关结构的信息对制造低成本、安全而有效的药物非常有用。最近，用MS测定完整的血浆蛋白质的聚糖氧化程度已成为诊断糖尿病的手段。ESI和MALDI-TOF MS在糖蛋白鉴定中得到了广泛应用。MALDI-TOF MS在使用反射式仪器时会产生亚稳碎裂和加合物，这大都取决于所用的基体。研究表明，在大分子糖蛋白中，所用基体会影响碎裂程度。Karas等指出对蛋白进行MALDI-TOF MS分析时，3-羟基吡啶甲酸比其他基体更好。鉴定糖蛋白，必须先用化学法或酶将蛋白切成糖肽，再用HPLC,CE和MS检测已确定糖基化的位置、程度或不均匀性。如测定需要，可用MS分析和Edman降解法检测每个糖肽/肽的氨基酸序列。另外，糖类(寡糖或聚糖)可从蛋白或肽中分解而释放出，并用MS和/或NMR指认。Apffel等用HPLC,ESI-MS和MALDI-TOF MS并结合以选择性酶修饰法鉴定Desmodul salvary血纤维蛋白溶酶原活化剂中的N-键合糖基化模式，并列出了CE,ESI-MS和MALDI-TOF MS鉴定Desmodul salvary血纤维蛋白溶酶原活化剂的结果。Boss等在高压下用CE对肽和糖肽进行多重顺序部分采集。从糖蛋白中释放并被纯化成单相的糖类的鉴定(寡糖或多糖)，需要测定键合位置、差头构型及鉴别单糖结构单元。不对糖共轭物做进一步化学预处理的直接MS分析可提供单糖序列和分子量信息，有时还能给出配糖的键合位置。测定单个糖分子的序列和键合情况，通常先将样品与一系列外糖苷酶反应以完成水解，再进行MS分析。用MALDI-TOF MS分析寡糖时，欲获得低检出限和有限的碎片，所用的基体是很重要的。Harvey等用MALDI-TOF MS及多种基体研究复杂的寡糖，发现2，5-DHB是最合适的基体。将外切糖苷酶水解与MALDI-TOF-MS结合可对pmol级糖缀合物和寡糖进行结构鉴别。Hildegard等在水中加入6-氮杂-硫胸腺嘧啶(ATT)作为基体，在使用前用低浓度挥发性缓冲液(如醋酸铵)使酶透析，再用质谱对所得产物进行分析，可提供有关反应完全度和糖缀合物性质，如单糖序列、分支情况等信息。结果表明在含有ATT的基体中，所有使用的外切糖苷酶能保持其活性。我们用HPLC/MS，CE/MS和MALDI-TOF MS研究了人促红细胞生成素(EPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等8种基因工程药物或蛋白的结构及其与生物活性相关性，特别是对EPO作了详细研究，确定了糖链在糖蛋白中的位点等，取得了满意的结果。
2.5　抗原决定部位指认　抗体可以识别线型(连续的)抗原决定部位或非线型(构象型的)抗原决定部位。Zhao等建立了一种质谱法，可快速指认束缚在单克隆抗体的蛋白中的线型抗原决定部位。抗体蛋白可由蛋白水解酶水解，产生适当序列的肽段，包含线型抗原决定部位的肽段用单克隆抗体进行免疫沉淀而从肽段中筛选出，经过免疫沉淀的肽用MALDI-TOF MS进行鉴定。此法适用于有相对较低的亲和力的抗体，即适用于大多数结合线型抗原决定部位的抗体。Zhao等用质谱测定了抗体-抗原相互作用，发表了几种亲和力在μmol和nmol范围的单克隆抗体的抗原决定部位指认的亲和质谱。如在发生亲和前对抗原进行水解，会丢失不连续的抗原决定部位及包含酶切点的抗原决定部位。Parke等鉴定了由单克隆抗体识别的HIV-1IIB p26的官能抗原决定部位。为了鉴定抗原决定部位，完整蛋白在生理条件下被亲和束缚在一个固相的单克隆抗体上。将各种不同的蛋白水解酶结合进行切割可去除未被保护的残基。用MALDI-TOF MS可测定抗原与抗体相连接并受保护以免发生蛋白水解的部位。此方法的特征是抗原留在原始构象上，因此也可测定构象型的(非连续的)抗原决定部位。Macht等结合使用了两种方法,一是对束缚在抗体上的抗原进行限制性蛋白水解，接着除去未束缚的肽；另一则是将一个抗原酶解，然后用抗体提取抗原肽。对于产生心肌梗塞、肌红蛋白、肌钙蛋白T的抗原决定部位结构鉴定，展示了一种不需要对单克隆抗体事先进行固化的方法。用超滤作用将非抗原决定部位从束缚在抗体上的肽中分离出，每个提取的组分不经纯化用MALDI-TOF MS分析。
2.6　蛋白和蛋白、低聚核苷酸及金属之间的作用　MALDI-TOF MS与蛋白水解相结合用于分析p21-B溶液和p21-B与Cdk2 1∶1混合物的激酶抑制性结合区的水解。p21-B/Cdk2复合物的蛋白水解的分析，用天然同位素丰度和15N标记的p21-B，发现p21-B中有一含22～36个氨基酸的片段未受胰蛋白酶切割，说明这一片段包含p21-B的Cdk2结合部位。此法还可用于蛋白-DNA复合物分析。Cheng等用ESI-MS对蛋白-低聚核苷酸复合物，即噬菌体f1中基因V蛋白与几种低聚核苷酸的复合物进行了当量测定。Jensen等提出了一种基于MALDI-TOF MS和ESI-MS的方法，将质谱法与紫外光引发蛋白质光化学交联到核酸上的方法相结合来定位并鉴定共价结合的氨基酸和核苷酸残基。MALDI-TOF MS也用于研究蛋白和低聚核苷酸间的非特异性反应。非共价复合物的形成则与蛋白本身的低聚核苷酸碱基及氨基酸组成有关。Przybylski用负离子ESI-MS分析了酶-底物-抑制剂复合物。可通过改变溶解条件和增加去溶剂化电势使非共价蛋白与低聚核苷酸复合物的特定离子选择性地离解。ESI-MS为直接鉴定非共价复合物开辟了新的前景。Birendra等讨论了用ESI检测分子量在19～34 ku的非共价复合物，研究的内容包括① 蛋白-配体相互作用［以ras蛋白与二磷酸鸟苷(ras-GDP)间的相互作用为例］；② 抑制物-蛋白-配体相互作用［以有机抑制物SCH 54292和SCH 54341与ras蛋白及二磷酸鸟苷(SCH 54292/SCH 54341-ras-GDP)间的相互作用为例］；③ 蛋白-蛋白相互作用(以γ-干扰素同源二聚体γ-IFN homodimer为例);④ 蛋白-金属复合物(以肝炎C病毒1-181与金属锌［HCV(1-181)-Zn］间的相互作用为例)。在这些例子中，ESI-MS法均能使非共价复合物由原始溶液状态变为气相的多电荷离子。检测的分子量误差小于0.01%。研究表明，用ESI-MS对共价复合物研究的成功关键在于严格控制ESI源的参数(如小孔电压)及样品溶液的条件(如溶液pH值及避免使用有机助溶剂等)。
2.7　细胞和病毒分析　近年来，对单细胞进行直接化学分析越来越受重视。Hofstadler等证明用毛细管电泳/电喷雾离子化傅立叶变换离子回旋共振质谱法(CE/ESI-FTICR)分析直接从一个小的完整活细胞群(5～10个)中得到的蛋白是可行的。选人体红细胞作模型体系，列出了从10个人体红细胞(4.5 mol Hb)中得到的血红蛋白(Hb)的α-和β-链的高分辨率质谱(平均分辨率>45 000),此谱图是在线获得的。此法适用于更大的哺乳动物细胞的研究。Valaskovic等用CE/MS分析鉴定混合物中的生物分子，用付立叶变换质谱仪(FT-MS)研究了8～29 ku蛋白，进样量为10-18 mol，分辨率约60 000，分子量误差小于1 u。用从人体血液中粗略分离的样品，测出碳酸酐酶分子量为28 780.6 u(计算值28 780.4 u)，只占单个血红细胞总蛋白质质量的1%。Hollend等用MALDI-TOF MS通过与已有的参照谱图比较或与已知细菌的培养液进行共同分析而对整个细菌进行鉴定。Berkemnkamp等用IR/MALDI-TOF MS分析冻干蛋白、风干的蛋白溶液或分子量小于30 ku的蛋白晶体时，没有添加其他基体而获得成功。
　　质谱已成为肽和蛋白分析的重要工具，由于ESI和MALDI等软电离技术的应用，可快速、准确地测定生物大分子。由于它自身的优势，相信它在肽和蛋白的研究中会发挥更大作用。