Falck-Hillarp甲醛诱发荧光法

互联网2010-12-02

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Falck-Hillarp 甲醛诱发荧光法

去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、5―羟色胺、组胺等生物单胺类物质在组织内的含量甚微，需用高敏感性的技术方法才能在细胞水平显示。生物胺荧光组织化学是在诱发荧光的基础上建立的一种特异性强、敏感性高的技术方法。

常用醛类诱发生物胺荧光的方法有Falck-Hillarp甲醛诱发荧光法、乙醛酸诱发生物单胺类荧光以及邻苯二醛诱发组织胺荧光法。

该法主要用于显示儿茶酚胺(catecholamine，CA)，如去甲肾上腺素、多巴胺及5―羟色胺等。

1．原理

甲醛与儿茶酚胺等生物胺冰冻干燥后，先经过闭环作用，再经脱氧反应，形成3，4―二氢异喹啉，在适当pH下，后者成为互变异构醌型结构而产生强荧光，其最大激发波长和最大发射波长分别为410nm和480nm。

2．组织标本制备

(1)铺片：对于富含交感神经支配的去甲肾上腺素能纤维的虹膜、肠系膜和皮下结缔组织等可以制备铺片。

以虹膜为例，其铺片过程如下：取出眼球，在解剖显微镜下尽量除去周围结缔组织，用虹膜剪沿眼球前部环形剪开，剔除晶状体，将角膜向下置于清洁的载玻片上，再用钟表镊将虹膜从睫状体撕下，将其在清洁的载玻片上铺展成虹膜原本的形状，用滤纸将周边液体吸干后，置于含P2 O5 的真空干燥器内过夜。其他组织亦可采用同样方法制作铺片。

(2)脑组织涂片：将小块脑组织置于清洁载玻片上，用另外的载玻片呈锐角推过该脑组织，制作均匀的脑涂片，方法类似制作细胞涂片，干燥同前。脑涂片的组织结构虽较紊乱，但可通过荧光膨体测量儿茶酚胺含量，作为药理学干预或损伤的一种快速普查法。

(3)冰冻干燥法：取脑组织(1．0cm×0．5cm×0．5cm)置于OCT包埋剂内(可按切片需要调整组织块方向)，用液氮速冻，然后进行冷冻干燥，组织块亦可在液氮中保存。已干燥的组织块置P2 O5 的干燥器内再继续干燥数天。

3．甲醛处理

将已干燥的组织标本与含5g多聚甲醛的小器皿一同置入80％的烘箱内l―3小时，肾上腺素的反应较慢，需3小时左右，而后移至暗处，逐渐恢复至室温(一般为25％)后，水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。

4．结果

儿茶酚胺中多巴胺、去甲肾上腺素神经元为黄绿色荧光，轴突前末梢较细胞体和膨体更易显示；5－羟色胺神经元为黄色荧光。

5.注意事项

(1)多聚甲醛试剂含水量的多少对结果影响较明显，含水量太少，所诱发的荧光弱，则显示含单胺结构少，而含水量多时．荧光物质会发生弥散。

所以，实验前最好先将多聚甲醛经含水量恒定处理，即将一定量(如50g)的多聚甲醛置于适当大小的培养皿内与500ml硫酸(相对湿度为70％左右)共同置于干燥器中，盖好干燥器盖，室温下放置7―10天。

(2)如显示5―羟色胺神经元，最好用单胺氧化酶抑制剂(如帕吉林，pargyline)预处理，再经5―羟色胺前体孵育，将有利于5―羟色胺神经元的显示。