乙醛酸诱发生物单胺荧光法

互联网2010-12-02

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乙醛酸诱发生物单胺荧光法

1．原理 乙醛酸与儿茶酚胺、去甲肾上腺素、多巴胺及5-羟色胺等生物胺的化学反应也是先经闭环，再经脱氢，与儿茶酚胺形成异喹啉类荧光产物或与5-羟色胺形成咔啉类荧光产物。

2．乙醛酸反应液配制(用前新鲜配制)

双蒸水 15.00ml

蔗糖(0．2mol/L) 1．37g

磷酸二氢钾(0．236mol/L) 0．642g

结晶乙醛酸(2％) 0．40g

2NNaOH调至pH 7．4，约2．4ml

最后总量为20ml，加双蒸水至所需量即可。

3．染色程序

(1)取材：铺片或冰冻切片．经电扇或电吹风凉风吹干，数秒至数分钟；

(2)浸染：将组织标本反复浸入乙醛酸反应液3次，每次数秒至数分，室温；

(3)凉风吹于，约15―20分钟，此时标本表面呈磨玻璃状；

(4)将标本置于预先升温至95℃、亲豪和免负疫组织化学的烘箱内处理3～5分钟；

(5)水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。

4．结果 激发波长为410nm，发射波长为480～520nm时，儿茶酚胺呈绿黄色荧光，而5―羟色胺呈橘黄色荧光。

5．乙醛酸诱发荧光结合孔雀绿复染程序 醛类诱发荧光组织化学法显示结果中含儿茶酚胺的细胞和突起产生的荧光清晰，易识别，但周围组织结构不易辨别。

如果将一种阳离子染料，如孔雀绿(malachitegreen)等加入乙醛酸反应液内处理组织标本，在儿茶酚胺激发波长条件下，孔雀绿发橘红色荧光，而醛诱发的儿茶酚胺细胞和突起发黄绿色荧光，两者可形成鲜明的对比。其染色方法如下：

(1)在40ml乙醛酸反应液中，加入0．07g孔雀绿，完全溶解后离心，取上清液；

(2)新鲜组织冰冻切片或铺片制作同前；

(3)将切片或铺片短暂浸入乙醛酸/孔雀绿染色液中，约5秒，拭去组织周围和载玻片背面多余的液体；

(4)人不含孔雀绿的乙醛酸反应液中，不时摇动载玻片，充分接触反应液；

(5)取出标本，拭去多余液体，并彻底吹干(约10分钟)，此时切片略变暗；

(6)滴加矿物油覆盖标本，置预先升温至95~C的烘箱中加热3分钟；

(7)将标本逐渐恢复室温，封片，荧光显微镜观察；

(8)结果：在肾上腺髓质、小肠壁等部位可见很多含儿茶酚胺的细胞发出荧光。

6．注意事项

(1)乙醛酸反应液必须临用前配制，每次用量约20ml；

(2)乙醛酸诱发荧光法对中枢和外周神经组织冰冻切片儿茶酚胺显示的较好。而对十枢神经组织；―羟色胺的显示不够理想．但对胃肠APUD细胞的5―羟色胺显示较好。