滚动式循环放大法IHC增敏方法

滚动式循环放大（RCA）法是一种能够在恒温条件下，使标记有寡核苷酸探针（与组织细胞内的核苷酸无相关性）的抗体（特异性一抗或第二抗）与组织细胞内的抗原结合后，在DNA聚合酶的作用下，加入的寡核苷酸进行循环扩增，产生一条扩增的DNA序列拷贝产物。

此时，标记在抗体上的寡核苷酸得到有效扩增（109倍），扩增后的产物与后续加入的标记有示踪物的寡核苷酸进行互补杂交，在抗原-抗体周围形成众多带有标记示踪物的杂交体，最后通过IHC方法再放大示踪物。

该方法具有很高的敏感性和特异性。首先要合成三条寡核苷酸探针（引物），然后将寡核苷酸与抗体结合，最后进行RCA免疫组化染色。

左上为寡核苷酸标记的特异性抗体与组织细胞内的特异性抗原结合；右上为DNA聚合酶作用下与放大抗体分子上结合的核苷酸；左下为用标记示踪剂的寡核苷酸进行互补杂交；右下为用IHC方法进一步放大检测

（一）寡核苷酸的合成与抗体连接寡核苷酸

L标记抗体用寡核苷酸

5,-AAAAAAAAAAAAAAAAATGATCACAGCTGAGGATAGGACATGCGA-3,

2. 循环放大寡核苷酸

5,-PCGCATGTCCTATCCTCAGCTGACAGAACTCACCTGTTAGACGCCACCAGCTCCAACTGTAAGATCGCTTAT-3,

3. 带有标记物的互补检测用寡核甘酸

5,-XACTGTGAAGATCGCTTATX-3,（X=生物素），或用5,-FACTCTGAAGATCGCTTATF-3,（F=荧光素）；或用5,-HRPACTGTGAAGATCGCTTAT HRP-3,（HRP=辣根过氧化物酶）。

（二）寡核苷酸与抗体的结合

连接用的抗体可以是特异性一抗，也可以是第二抗体或其他的连接二抗，如抗地高辛（Dig）、抗荧光素（FITC）或抗生物素（biotin）二抗。

1. 抗体的脱盐和活化

首先对抗体免疫球蛋白进行脱盐，然后进行抗体活化。在41 nmol抗体分子中加入410mmol的GMBS[硫代-N-（4-马来酰亚胺丁酰）硫代丁二酰亚胺，sulfo-N-（4-maleim-idobutyryloxy）sulfosuccinimide],暗处，37℃，在氮气中30 rain,移人室温中继续反应30min,用PD-10色谱柱（用pH7.5 PBS平衡柱子）除去多余的磺化-GMBS,将活化抗体4℃浓缩。此时每一个抗体分子中含有多个马来酰亚胺，可以用Ellman's试剂滴定活化抗体的量，主要测定抗体分子上的巯基。抗体活化后与寡核苷酸连接。

2. 活化抗体与寡核苷酸结合

将28.1nmol磺化GMBS活化抗体和142 nmol5硫醇寡核苷酸混合，总体积为825ul,室温中反应2h,随后移人4℃中反应过夜。

3. 纯化结合物

纯化结合物一般先用阴离子交换色谱柱Q-sepharose（先用梯度盐洗柱，然后加样，洗脱，收集结合物），再用SephadexG-200色谱柱除去游离的寡核苷酸。纯化后结合物中寡核苷酸和抗体之比为10:1，多数情况下，1个抗体分子可结合3~5个寡核苷酸。

（三）RCA免疫组化染色

（1）石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复后，PBS洗3×3min。

（2）滴加特异性一抗，37℃孵育1h，PBS洗3×3min。

（3）滴加适当稀释的寡核苷酸标记二抗IgG 200nmol/L（用100mmol/L谷氨酸钾-PBS稀释），37℃孵育30min，PBS洗3×3cm，用100mmol/L谷氨酸钾洗。

（4）循环寡核苷酸（170mmol/L），用φ29缓冲液稀释[缓冲液内含250mmol/L（pH7.5）Tris-HCl，50mmol/L MgCl2，1mg/ml BSA，lmmol/L dATP，1mmol/L dCTP，1mmol/LdGTP，0.75 mmol/LdTTP，0.25mol/LFITC-12-dUTP]，40ul/每片，37℃孵育30min，不洗，每张切片加入1ulφ29 DNA聚合酶（0.4U/ul），37℃继续反应30min，PBS洗3×3min。

（5）免抗FITC-AKP结合物1:1000稀释，37℃30min;PBS洗3× 3min；0.02mol/LTris-HCl（pH9.0内含氯化镁、左旋咪唑）洗20min.

（6）NBT/BCIP显色30~240min，核固红衬染。

（7）常规树胶封片，结果观察。