原位免疫PCR的IHC增敏方法

（一）基本原理

Sano等（1992）率先利用基因工程的方法表达了A蛋白与链霉亲和素的嵌合体分子获得成功，建立了免疫PCR技术。这是一种新的抗原检测系统，利用细胞工程和基因工程技术，巧妙地将抗原抗体反应的特异性同PCR的敏感性相结合，通过构建单克隆抗体与重组核酸的嵌合体分子，使得利用PCR技术检测蛋白成为可能。随后在免疫PCR的基础上，建立了在细胞或组织原位检测抗原的原位免疫PCR（in situ immuno-PCR）。

原位免疫PCR是一种检测系统，需要一种中介分子同时具有与DNA和抗体分子特异性结合的能力，其一端连接DNA,另一端连接抗原-抗体复合物，形成一个抗原-抗体-DNA连接物。作为标记的DNA分子用PCR扩增，检测特异的PCR产物，即可间接证明抗原的存在。该技术与原位PCR不同，就是在PCR与原位杂交之间加了抗体的因素。原位PCR是先对切片或涂片进行PCR,以对组织细胞内的DNA或RNA进行扩增，使其拷贝数大大增加，然后再进行原位分子杂交。而该技术是先用特异性抗体（单抗）与相应或目的抗原反应。这个抗体在对抗原反应之前加上了人体不存在的或无关的DNA序列。抗体与抗原特异性反应后，用PCR扩增加在抗体上的DNA序列，然后再用该DNA序列的探针进行杂交检测，也就是说用PCR及杂交的方法来放大免疫组织化学的反应，检测目标是蛋白质。

（二）操作流程

（1）4um石蜡切片常规脱蜡至水。

（2）0.3%H₂O₂处理20min；PBS洗3min×3。

（3）抗原修复，或3mol/L酶消化；PBS洗3min×3。

（4）加入特异性一抗，37℃，1h；PBS洗3min× 3。

（5）加人生物素化二抗（1:400），37℃，1h；PBS洗3min× 3。

（6）加入链霉亲和素（1:100），37℃，1h；PBS洗3min× 3。

（7）加人生物素化pUCl9 DNA；20ng/片37℃，1h；PBS洗3min× 3。

（8）PBS洗，进行原位PCR反应（在原位PCR仪上进行）。50×反应液中含25umol/L引物1ul，2mmol/L dUTPs（1mmol/L dTTP和生物素-dUTP、20mmol/L dATP和dCTP）各lul，10X缓冲液5ul，Taq酶2U。原位PCR程序为：94℃，40s；55℃，40s；72℃，20s；循环30次，最后72℃延伸5min；PBS洗3min×3。

（9）加入链霉亲和素-HRP（1;200），37℃，30rain;PBS洗3min×3.

（10）DAB+H₂0₂显色。

（11）常规苏木精衬染和封片。

（三）应注意的问题

（1）防止非特异性染色。所用的外源性DNA片段和引物必须和人体内基因或被检靶细胞中无互补系列，防止非特异性结合，出现假阳性。

（2）采用尿素或微波抗原修复方法替代酶消化切片，避免微量残存蛋白酶对Taq酶的降解，影响PCR扩增的效率，使敏感性下降。

（3）防止脱片，充分洗涤，防止非特异性结合和扩散。

（4）必须设计各种阳性和阴性对照。

以上方法主要是增加免疫组化敏感性的方法，当然再敏感也应保持特异性，不然提高敏感性就毫无意义，敏感性是在保留特异性的基础上发展起来的。