丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
丁香通
点赞
收藏
wx-share
分享

原位免疫PCR的IHC增敏方法

互联网

1563

(一)基本原理

Sano等(1992)率先利用基因工程的方法表达了A蛋白与链霉亲和素的嵌合体分子获得成功,建立了免疫PCR技术。这是一种新的抗原检测系统,利用细胞工程和基因工程技术,巧妙地将抗原抗体反应的特异性同PCR的敏感性相结合,通过构建单克隆抗体与重组核酸的嵌合体分子,使得利用PCR技术检测蛋白成为可能。随后在免疫PCR的基础上,建立了在细胞或组织原位检测抗原的原位免疫PCR(in situ immuno-PCR)。

原位免疫PCR是一种检测系统,需要一种中介分子同时具有与DNA和抗体分子特异性结合的能力,其一端连接DNA,另一端连接抗原-抗体复合物,形成一个抗原-抗体-DNA连接物。作为标记的DNA分子用PCR扩增,检测特异的PCR产物,即可间接证明抗原的存在。该技术与原位PCR不同,就是在PCR与原位杂交之间加了抗体的因素。原位PCR是先对切片或涂片进行PCR,以对组织细胞内的DNA或RNA进行扩增,使其拷贝数大大增加,然后再进行原位分子杂交。而该技术是先用特异性抗体(单抗)与相应或目的抗原反应。这个抗体在对抗原反应之前加上了人体不存在的或无关的DNA序列。抗体与抗原特异性反应后,用PCR扩增加在抗体上的DNA序列,然后再用该DNA序列的探针进行杂交检测,也就是说用PCR及杂交的方法来放大免疫组织化学的反应,检测目标是蛋白质。

(二)操作流程

(1)4um石蜡切片常规脱蜡至水。

(2)0.3%H2O2处理20min;PBS洗3min×3。

(3)抗原修复,或3mol/L酶消化;PBS洗3min×3。

(4)加入特异性一抗,37℃,1h;PBS洗3min× 3。

(5)加人生物素化二抗(1:400),37℃,1h;PBS洗3min× 3。

(6)加入链霉亲和素(1:100),37℃,1h;PBS洗3min× 3。

(7)加人生物素化pUCl9 DNA;20ng/片37℃,1h;PBS洗3min× 3。

(8)PBS洗,进行原位PCR反应(在原位PCR仪上进行)。50×反应液中含25umol/L引物1ul,2mmol/L dUTPs(1mmol/L dTTP和生物素-dUTP、20mmol/L dATP和dCTP)各lul,10X缓冲液5ul,Taq酶2U。原位PCR程序为:94℃,40s;55℃,40s;72℃,20s;循环30次,最后72℃延伸5min;PBS洗3min×3。

(9)加入链霉亲和素-HRP(1;200),37℃,30rain;PBS洗3min×3.

(10)DAB+H202显色。

(11)常规苏木精衬染和封片。

(三)应注意的问题

(1)防止非特异性染色。所用的外源性DNA片段和引物必须和人体内基因或被检靶细胞中无互补系列,防止非特异性结合,出现假阳性。

(2)采用尿素或微波抗原修复方法替代酶消化切片,避免微量残存蛋白酶对Taq酶的降解,影响PCR扩增的效率,使敏感性下降。

(3)防止脱片,充分洗涤,防止非特异性结合和扩散。

(4)必须设计各种阳性和阴性对照。

以上方法主要是增加免疫组化敏感性的方法,当然再敏感也应保持特异性,不然提高敏感性就毫无意义,敏感性是在保留特异性的基础上发展起来的。

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序