滚动循环放大法

滚动式循环放大（rolling circle amplification；RCA）法是一种能够在恒温条件下，使标记有寡核苷酸探针（与组织细胞内的核苷酸无相关性）的抗体（特异性一抗或第二抗）与组织细胞内的抗原结合后，在 DNA 聚合酶的作用下，加入的寡核苷酸进行循环扩增，产生一条扩增的 DNA 序列拷贝产物，此时，标记在抗体上的寡核苷酸得到有效扩增（10⁹ 倍），扩增后的产物与后续加入的标记有示踪物的寡核苷酸进行互补杂交，在抗原-抗体周围形成众多带有标记示踪物的杂交体，最后通过 IHC 方法再放大示踪物（原理见图 5-6）。该方法具有很高的敏感性和特异性。

1.1 标记抗体用寡核苷酸

5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATGATCACAGCTGAGGATAGGACATGCGA-3'

1.2 循环放大寡核苷酸

5'-PCGCATGTCCTATCCTCAGCTGACAGAACTCACCTGTTAGACGCCACCAGCTCCAACTGTAAGATCGCTTAT-3'

1.3 带有标记物的互补检测用寡核苷酸

5'-XACTGTGAAGATCGCTTATX-3'，（X=生物素），或用 5'-F ACTCTGAAGATCGCTTAT F-3'（F=荧光素）；或用 5'-HRP ACTGTGAAGATCGCTTAT HRP-3'（HRP=辣根过氧化物酶）。

2. 寡核苷酸与抗体的结合

连使用的抗体可以是特异性一杭，也可以是第二杭体，或其他的连接二抗。如抗地高辛（Dig）、抗荧光素（FITC）或抗生素（biotin）二抗。

2.1 抗体的脱盐和活化

首先对抗体免疫球蛋白进行脱盐，然后进行抗体活化，在 41 nmol 抗体分子中加入 410 mmol 的 GMBS [硫代-N-（4-马来酰亚胺丁酰）硫代丁二酰亚胺。sulfo-N-（4-maleimidobutyryIoxy）sulfosuccinimide]，暗处，37℃，在氮气中 30 min，移入室温中继续反应 30 min，用 PD-10 色谱柱（用 pH 7.5 PBS 平衡柱子）除去多余的磺化-GMBS，将活化抗体 4℃ 浓缩。此时每一个抗体分子中含有多个马来酰亚胺，可以用 Ellman’s 试剂滴定活化抗体的量，主要测定抗体分子上的巯基。抗体活化后与寡核苷酸连接。

2.2 活化抗体与寡核苷酸结合

将 28.1 nmol 磺化 GMBS 活化抗体和 142 nmol 5'-硫醇寡核苷酸谱柱混合，总体积为 825 μl ，室温中反应 2 h，随后移入 4℃ 中反应过夜。

2.3 纯化结合物

纯化结合物一般先用阴离子交换色谱柱 Q-sepharose（先用梯度盐洗柱，然后加样，洗脱，收集结合物）。再用 Sephadex G-200 色谱柱除去游离的寡核苷酸。纯化后混合物中寡核苷酸和抗体之比为 10:1，多数情况下，1 个抗体分子可结合 3～5 个寡核苷酸。

3. RCA 免疫组化染色

3.1 石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复后，PBS 洗 3×3 min。

3.2 滴加特异性一抗，37℃ 孵育 1 h，PBS 洗 3×3 min。

3.3 滴加适当稀释的寡核苷酸标记二抗 IgG 200 nmol/L（用 100 mmol/L 谷氨酸钾-PBS 稀释）、37℃ 孵育 30 min，PBS 洗 3×3 min，用 100 mmol/L 谷氨酸钾洗。

3.4 循环寡核苷酸（170 mmol/L），用 φ29 缓冲液稀释 [缓冲液内含 250 mmol/L（pH 7.5）Tris-HCl，50 mmol/L MnCl₂，1 mg/ml BSA，1 mmol/L dATP，1 mmol/L dCTP，1 mmol/L dGTP，0.75 mmol/L dTTP，0.25 mmol/L FITC-12-dUTP]， 40 μl/每片，37℃ 孵育 30 min，不洗。每张切片加入 1μl φ29 DNA 聚合酶（0.4 U/μl），37℃ 继续反应 30 min，PBS 洗 3 × 3 min。

3.5 兔抗 FITC-AKP 结合物 1:1000 稀释，37℃ 30 min；PBS 洗 3×3 min；0.02 mol/L Tris · HCl（pH 9.0 内含氯化镁、左旋咪唑）洗 20 min。

3.6 NBT/BCIP 染色 30～240 min。核固红衬染。

3.7 常规树胶封片，结果观察。