【原创】MSP实验方案

大家好，课题是结肠癌甲基化方面，我想先把DNA ,RNA和蛋白质提取出来保存，以下是我的初步方案，请大家不吝指教,谢谢哦！

RNA 抽提

1. 匀浆处理

将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%

2.将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

4. 4℃ 12000g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。

5. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

6. 4℃ 12000g离心15分钟。离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

7. 移去上清。用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。

8. 4℃ 7500g离心5分钟，弃上清。

9.超净工作台开风机干燥约30min（不能完全干燥）

10.溶于DEPC水中至20µL（10µL-20µL），可在55-60℃水中，<10min助溶

11.立即保存于-70℃冰箱中，或立即用于逆转录。

DNA抽提

1. 样品加氯仿分层后，移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀。室温放置3分钟

2. 4℃不超过2000×g离心5分钟。

3. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，4℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。

4. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5～2 ml75%乙醇，室温放置10～20分钟（不时颠倒混合）4℃2000×g离心5分钟， 弃上清。

5. 室温放置晾干DNA 5～15分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从50～70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于500μl 8mM NaOH，DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl。

提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE，HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。

6. 上清可以在4℃存放过夜。长时间保存需要用HEPES加1Mm EDTA调整pH至7-8

蛋白质的提取

操作步骤：

1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2～8℃12000×g离心10分钟弃上清。

2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。

3.真空抽干蛋白质沉淀5～10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。