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【原创】MSP实验方案

丁香园

3066

大家好,课题是结肠癌甲基化方面,我想先把DNA ,RNA和蛋白质提取出来保存,以下是我的初步方案,请大家不吝指教,谢谢哦!

RNA 抽提

1. 匀浆处理

将组织在液氮中磨碎,每50~100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%

2.将匀浆样品在室温(15~30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。

3.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。

4. 4℃ 12000g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。

5. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。

6. 4℃ 12000g离心15分钟。离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

7. 移去上清。用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。

8. 4℃ 7500g离心5分钟,弃上清。

9.超净工作台开风机干燥约30min(不能完全干燥)

10.溶于DEPC水中至20µL(10µL-20µL),可在55-60℃水中,<10min助溶

11.立即保存于-70℃冰箱中,或立即用于逆转录。

DNA抽提

1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀。室温放置3分钟

2. 4℃不超过2000×g离心5分钟。

3. 移去上清,(如需分离蛋白质,可保留,进一步操作见后)用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟,4℃2000×g离心5分钟,弃上清,重复一次。

4. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀,每用1ml TRIzol加入1.5~2 ml75%乙醇,室温放置10~20分钟(不时颠倒混合)4℃2000×g离心5分钟, 弃上清。

5. 室温放置晾干DNA 5~15分钟,用8mM NaOH溶解DNA。从50~70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于500μl 8mM NaOH,DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl。

提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中,建议用弱碱溶解,8mMNaOH的pH值为9,溶解DNA后可用TE,HEPES调节pH。从某些样品(尤其是组织)中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。

6. 上清可以在4℃存放过夜。长时间保存需要用HEPES加1Mm EDTA调整pH至7-8

蛋白质的提取

操作步骤:

1.取沉淀DNA后剩余的上清,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇,室温放置10分钟,2~8℃12000×g离心10分钟弃上清。

2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液,室温放置20分钟,2~8℃7500×g离心5分钟,弃上清,重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。

3.真空抽干蛋白质沉淀5~10分钟,用1%SDS溶解蛋白质,反复吸打,50℃温浴使其完全溶解,不溶物2~8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。

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