【原创】MSP的屌丝逆袭：跑不出条带的请进来

关于MSP，园子里的讨论帖子不少，但很多战友还是跑不出条带。此帖结合本人的亲身经历，就MSP提些建设性的意见，谨奉献给仍奋斗在一线的战友们。

先简要的说说MSP法的原理，即用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR，然后通过电泳图检测甲基化状态。

本人研究的课题是一个常见的抑癌基因，前期的研究发现此基因的表达在研究疾病中是低表达状态，结合一些文献报道，推测此基因可能存在DNA启动子高度甲基化，所以也是个探索性的实验。

关于甲基化引物的设计，这里就不叙述了，本人直接参考了文献的甲基化和非甲基化两对引物，找了几篇文献都提到两对相同的引物，比对后也是没用任何问题的。

引物序列如下：

甲基化引物：forward:5′-GTTTGGGGATTTTTTTTTCGC-3′

reverse: 5′-AACCCTTCCTACGCCGCG-3′

非甲基化引物：forward:5′-TATTAGTTTGGGGATTTTTTTTTTGT-3′;

reverse: 5′-CCCAACCCTTCCTACACCACA-3′

于是就订购合成了。之前看到园子里说跑甲基化引物是非常重要的，还有就是热启动酶，这个引物论坛里也有人发过帖，但结果不是很好，所以不免有些担心，毕竟前面的师兄师姐们都做过甲基化，最后也是无疾而终，要么放弃这部分，要么送公司做了。

DNA提取对我来说没有问题，每个月本人至少也要提50个左右的样本。在亚硫酸氢钠处理之前测了下浓度，取10ul的DNA做甲基化，试剂盒用的是QIAGEN 的EpiTect Bisulfite Kits。每一步骤严格按照说明书上的进行，处理和提纯用了大概6个小时左右完成。

次日就按照文献中的条件跑完PCR跑胶，分别用了一般的热启动酶和HotStar酶，结果像预期的那样没有条带，然后我用了一个多月在不停的换引物，一来一去的换了四对引物，退火温度从55度摸到65度，最后还是什么都没有。

想让人绝望了，处理过的DNA用完了，只能再提一批。老板让我不行的话就送公司，我就奇了怪了，如此成熟的技术，为什么我就不行了呢？

我一方面继续找文献，看看还有什么没有注意到的，另一方面在园子里把有关MSP的帖子都看了个遍，想想当时也是打了鸡血一样，有时晚上回来看到一两点。还得感谢下丁香园，终于有一个回帖中有人提到用巢式PCR，当然还有提到用降落PCR，对比下巢式具有明显的优势。

然后我搜索了巢式PCR和甲基化的文献，我的目的基因有人是跑过的，何不尝试下呢？毕竟第二轮引物的扩增是非常特异的，也许就是第一轮的产物量不够不足形成带的，我如此的安慰自己，我期盼着奇迹的出现。

巢式侧翼引物如下：

Flanking sense：GAGGAGTGGTATTAGTTTGG

Flanking antisense：CAAACAACAAAACCCCAACCCTT

又是一个晚上，像平常一样，经历了两轮PCR后，我小心翼翼的做了一块琼脂糖胶。跑完电泳后染胶照光，也许是太久没有见到条带，但条带（大小相符，图3）从黑暗背景中显现出来的时候，我抑制不住兴奋的心情竟然要和老板打个电话（最后因为太晚也就没打了）。

长长的我舒了一口气，这个心结也就终于解开了。因为第二轮PCR的模板用的是第一轮稀释1000倍的产物，所以第二天又继续摸了一些浓度和温度，包括加一般的酶和HotStar酶的对比(图4)，毕竟HotStar酶不便宜呀，条件摸下来基本上用光了。