xCELLigence系统实时检测神经毒性

特征性研究：

xCELLigence系统实时检测神经细胞死亡

神经细胞死亡、xCELLigence系统、原代皮质神经元细胞、

HT-22 细胞、细胞阻抗、实时测定

作者：

在很多神经退化性疾病中发现了神经元凋亡与坏死。近几年来，神经科学研究中建立了几种细胞培养模式，用于体外细胞死亡机制的研究。尽管近年来科学界对神经元细胞死亡信号传导原理已经得了一定成果，但技术上的局限性依然存在，从而限制了对数据的采集与解读。而无法进行神经细胞死亡的实时监测是一个主要的技术瓶颈。目前为止，主要的细胞增殖、细胞生存与细胞死亡检测方法均为侵入式终点检测，通常对细胞有毒性，并需要对细胞进行破坏处理。

同时，对神经细胞死亡与潜在机制进行动态变化分析，需要大量的实验操作，涵盖持续的、多个时间点。目前有几种终点实验法，可进行特定凋亡时间点上的特异性分子事件的检测，如磷脂酰丝氨酸转位至细胞膜外部，线粒体功能障碍、半胱氨酸蛋白酶激活，以及 DNA 断裂（1）。这些终点测定的一个缺陷是，其无法确定实验凋亡时间点。为解决这个问题，研究人员需要重复对细胞死亡形态学改变进行监测。

目前，使用由罗氏与 ACEA Biosciences公司联合开发的实时细胞分析仪（Real-Time Cell Analyzers，RTCA）xCELLigence系统，应用非侵入式、无标记性技术，可对细胞进行持续监测。xCELLigence系统对将传感器微电极点阵整合入E-Plate 96培养孔底部，并对生长于上的细胞阻抗进行记录。阻抗测定记录的是细胞指数（Cell Index，CI）值，细胞贴附于电极后，当细胞形态学发生变化，会导致电流环路电阻改变，该电阻与细胞指数具有相关性。通过对细胞形态学改变、细胞粘附与细胞增殖的监测，xCELLigence 系统可追踪细胞变化与细胞死亡情况。

本研究中，我们使用xCELLigence系统，对类神经元细胞HT-22，及原代培养大鼠皮质神经元细胞，对不同细胞死亡刺激物的反应进行了研究。原代培养神经细胞的一个特征是其浓密的树突状网络，该网络在凋亡诱导后，可残留于组织反应板上。无论细胞本身是否已发生凋亡，凋亡神经元可残留贴附于细胞培养板上，并显示出一定的阻抗性。这种特性对原代神经元培养监测的影响，也是本次使用RTCA仪器进行研究的一个热点。而且，我们对xCELLigence系统对神经保护作用的监测能力进行了研究。出于这个目的，我们使用神经保护剂BI-6C9，BI-6C9是一种公认的BH-3 小分子抑制剂，可与死亡激动剂（domain death agonist，BID）发生相互作用，是 Bcl-2基因家族的预凋亡成员（4，5）。

总之，研究表明，xCELLigence系统可通过多方面实验，持续对神经细胞培养进行监测，所进行的实验包括接种反应板、预培养、增殖胶质细胞的去除、药物作用，以及对神经毒性与神经保护作用的确认。

材料与方法

HT-22类神经元细胞

按照指定密度接种 HT-22细胞于 96-孔 E-反应板 96 （罗氏）或常规96-孔反应板（Greiner，Frickenhausen）上，并生长于 DMEM培养基 （德国 Karlsruhe，Invitrogen 公司）中，培养基中添加有10%热失活胎牛血清（FCS）、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml链霉素与 2 mM 谷氨酸 （德国 PAA Laboratories 有限公司）。

原代皮质神经元培养

如前述，原代皮质神经元细胞来自于胎鼠大脑 （E16-18） （4）。简言之，即分离皮质组织、轻柔胰酶消化后，机械分离神经元，并去除脑膜。将不同密度细胞接种于聚乙烯亚胺 （polyethylenimine，PEI） 预包被 96-孔 E-Plates 96 （Roche） 或标准 96-孔板（Greiner）中。培养基为神经细胞培养基 （Invitrogen） 添加有 5 mM HEPES、1.2 mM 谷氨酸、2% （v/v） B27 补充剂 （Invitrogen） 与庆大霉素（0.1 mg/ml）。培养 48 小时后，使用胞嘧啶-阿糖胞苷（cytosine-arabinofuranoside，CAF）处理 48 小时，抑制非神经元细胞的生长。然后，体外培养 6-7 天后，完全更换培养基，将神经元细胞用于下述实验。为对谷氨酸处理神经元细胞CI 值的改变进行监测，必须于培养第0天，于细胞中添加 1 µM CAF。

细胞增殖检测

根据细胞增殖试剂盒I （MTT）（罗氏）的说明书，通过比色MTT（3-[4,5-二甲基砷-2-yl] -2,5-溴化噻唑蓝四氮唑） 检测，对神经元细胞活性进行检测。通过自动FLUOstar Optima 读取仪（德国 Offenburg ，BMG Labtech）进行 570 nm培养孔的吸光度读取，参考过滤波长是 630 nm。

实时细胞分析使用 xCELLigence RTCA MP 仪器与 RTCA 软件1.2 进行 CI 值测定，并于 E-Plate 96 中进行持续监测。用100 µl DMEM含10% FCS进行HT-22细胞培养的背景阻抗检测，用100 µl 神经细胞基础培养基含2% B27进行神经细胞培养的背景阻抗检测。PEI 包被不会干扰细胞阻抗测定。相反，多聚-D-赖氨酸或多聚-L-赖氨酸包被可显著干扰原代皮质神经元的实时监测。对 HT-22 细胞持续监测 2 天，对原代皮质神经元细胞持续检测 12-14 天。

荧光与光学显微镜 – 于 PEI包被 IbiTreat µ-Slide 8-孔反应板（德国Munich，Ibidi） 上培养皮质神经元细胞，培养 6 天。然后，将培养细胞固定于 +4°C 磷酸缓冲液（PBS）（pH 7.4） 多聚甲醛中。使用 0.2% Triton X-100/PBS 对神经元细胞进行透化处理，使用 10% （v/v） 标准山羊血清（NGS）与2% （v/v） 牛血清白蛋白 （BSA）PBS，于室温处理 1 小时进行终止。+4°C 环境下，将神经元细胞与神经元标志微管相关蛋白 2 （microtubule-associated protein 2，MAP-2） （英国剑桥Abcam，ab11267， HM-2，1:600 稀释）小鼠单克隆抗体共同孵育，孵育过夜。第 2 天，将细胞与山羊抗小鼠二抗（Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG （H+L） （Invitrogen，1：250 稀释）共同孵育。使用DMI6000 B 倒置显微镜（德国，Leica ）收集荧光成像信息，LAS AF 软件（德国Mannheim，Leica Microsystems 公司Leica Application Suite, Advanced Fluorescence 2.2.0）分析。使用配备有 Lumenera Infinity 2 数字摄象机（加拿大 Ottawa，Lumenera 公司）的Axiovert 200 显微镜（德国 Jena ，Carl Zeiss ）获取光学显微镜的成像信息。10x 2.5 NA 物镜 （德国 Jena ，Carl Zeiss）采光，通过相差进行成像捕获。INFINITY ANALYZE 软件 （Lumenera 公司） 数字成像记录与成像分析。

结果

神经元 HT-22 细胞增殖

为对神经细胞系 HT-22 的生长与增殖情况进行评价，将细胞以不同密度（4500、8000 与 20000 细胞每孔） 接种于 E-Plate 96 上，并使用xCELLigence RTCA MP 仪器进行监测，监测 48 小时。首先细胞粘附于培养孔表面后，阻抗会显著增加，后期实验中，HT-22 细胞增长稳定。最终的各生长曲线，斜率非常相似，仅各培养孔绝对 CI 值不同，CI 值随各自接种密度的（参见图 1A 与 B）不同而不同。

为进行 HT-22细胞死亡诱导，使用不同剂量的谷氨酸（3 与 5 mM）。这些细胞中，谷氨酸可导致谷氨酰胺的消耗，从而促进活性氧的生成，导致线粒体损伤与细胞死亡（2，3）。谷氨酸处理后 8-10 小时期间，未检测到 CI 值改变。其后 4-6 小时期间，CI 值快速降低。阻抗曲线图反映出剂量依赖性的谷氨酸诱导的细胞死亡。阻抗测定后的E-Plate 96 反应板 MTT 实验结果进一步证实了本研究结果（参见图1C）。不同细胞接种密度与不同谷氨酸浓度下，细胞死亡的开始时间略有不同。如图 1B，xCELLigence记录阻抗图在药物给定时间点，对CI 值进行标准化。xCELLigence系统检测到的谷氨酸诱导的细胞死亡动态变化，同前期研究中谷氨酸诱导HT-22 细胞死亡的时间段及特征具有良好的重复性，包括线粒体断裂与细胞核 AIF 转位 （2，3，4）。

图 1：E-Plate 96 中的 HT-22 细胞浓度梯度，及谷氨酸毒性检测。（A） 将指定细胞密度的 HT-22 细胞接种于 E-Plate 96 上，并使用 xCELLigence 系统进行 48 小时记录。接种后 24 小时，使用谷氨酸对细胞进行处理。（B） HT-22 细胞指数 （CI） 值，在谷氨酸添加时间点进行标准化。（C） 持续性xCELLigence 细胞监测后，于 E-Plate 96 中进行 MTT 终点实验，对细胞活性进行检测。