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xCELLigence系统内源性GPCRs细胞功能研究

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xCELLigence实时细胞分析系统主要应用

受体活性
特征性研究
xCELLigence 系统内源性
GPCRs 细胞功能图




作者


Jeff Irelan (左)
美国圣地亚哥ACEA Biosciences 公司
Jonathan H. Morgan(右)
美国弗吉尼亚州Manassas ATCC 产品经理
原文(pdf版本):点击下载
前言
G-偶联蛋白受体(GPCRs),即 7-跨膜蛋白,是当今临床与科研药物的单一治疗靶点,也是迄今发现最大的靶点家族。据推测人基因组中,该家族的功能成员超过300个,涉及多种不同细胞与组织间的广泛信号途径。研究证实,对GPCR功能的调节,有助于免疫学、神经病学、心脏病学与肿瘤学领域多种疾病的治疗。
通过应用新的基于细胞水平的受体功能检测技术,候选药物对新调节子的确认率显著提高,损耗率(定义为临床前检测/临床试验失败率)降低。但基础研究获得的GPCR 功能数据很难被应用于临床疾病中。造成这种情况的原因是,传统细胞学实验往往(1)使用异源细胞,或相关性较低的细胞类型,进行人造受体的过表达;(2) 使用外源性检测试剂,如荧光标记试剂;(3)使用侵入性处理手段,像染料负载以及细胞裂解,(4)生成的数据仅为单一时间点的数据,而不是持续性细胞监测数据。
最近开发的生物相关性程度更高的实验系统,可显著改善 GPCR 药物开发与研究应用的成功率(1)。罗氏应用科学部的 xCELLigence 系统,不需要使用外源性标记,即可对疾病相关细胞的内源性GPCR功能进行实时评测。将细胞接种于含有微电极的培养板上,可对GPCR 激活导致的细胞骨架结构的微小变化与细胞收缩情况进行准确测定。
通过与细胞浆鸟嘌呤核苷结合蛋白或 G 蛋白结合偶联,GPCRs 可进行细胞的信号传导活动。所有主要的与 G 蛋白偶联的第二信使通路,都已被发现会激活环化AMP/蛋白激酶 A、钙离子/磷酸酶 C、β-抑制蛋白/MAPK,以及 Rho 家族 GTP酶,使细胞发生形态学改变。而xCELLigence 系统可通过记录细胞阻抗,很容易对形态学改变进行检测(2),从而完成对GPCR的检测。
与传统检测方法相比,形态学阻抗测定可对多个信号途径累积效应进行捕获。内源性GPCR 功能测定的优势包括(1)对靶受体进行评价是在其正常表达水平上;(2)在调节因子包括激素或异源性二聚体存在情况下,对受体之间的天然相互作用情况进行分析;(3)允许 GPCR 与细胞内 G 蛋白的天然偶联。同时,应用实时无标记xCELLigence 检测系统,可动态实时地记录实验期间的所有阻抗信息,从而对所有GPCR的反应进行检测。通过单一检测即可对 GPCR 激活导致的所有第二信使途径进行测定,从而有效降低试剂成本。
本研究中,我们发现 xCELLigence 系统是一种灵敏的、可靠的检测系统,用于持续内源性 GPCR 功能测定。研究中我们对涉及 24 个治疗相关受体家族的一组 43 个配体(参见表 1)进行了测定,并生成了相关GPCR功能图谱。实验涉及通用的肿瘤细胞系、HeLa、U2OS、SH-SY5Y 与 CHO-K1,以及 疾病相关的原代细胞:人血管内皮细胞与混合肾上皮细胞。


= 最大细胞指数值超出缓冲液对照的3倍标准差
= 最小细胞指数值低于缓冲液对照的3倍标准差

表 1:GPCR 功能图概述
材料与方法
细胞系与培养条件:细胞系来自于ATCC。按照 ATCC 的建议进行HeLa(#CCL-2)、U2OS (#HTB-96)、SH-SY5Y(#CRL-2266)、CHO-K1 (#CCL-61)、人血管内皮细胞(HUVEC;# PCS-100-010 批号 58570370)与混合肾原代上皮细胞(MREC;ATCC # PCS-400-012 lot # 58488854)的培养,肿瘤细胞系传代至 10 代以上,原代细胞系传代至 4 代。
检测程序:所有检测均于组织培养器(5% CO2,37°C )中进行。细胞培养基为生长培养基,细胞接种密度是 1-2 x 104 细胞每孔,接种于96孔E-Plates 中,并通过xCELLigence 系统进行过夜监测,直至细胞生长至接近满板,复孔检测。预先在另一普通96孔板中每孔中添加 2 µl 药物,并储存于 -20℃。待细胞培养 18-24 小时后,进行药物稀释反应。将药物融解,并添加 132 µl 检测缓冲液(1 x HBSS,Sigma H8264、20mM HEPES,Cellgro 25-060-Cl、0.1% BSA,Fisher Scientific #BP1600)对其进行稀释处理。从培养箱中移除 E-Plates 96,使用检测缓冲液进行洗涤,洗涤一次,并使用Biotek MicroFlo Select,于每孔中添加 140 µl 检测缓冲液。将 E-Plates 96 放回至RTCA MP 站,放置15 分钟,进行细胞平衡。然后使用 Beckman Multimek 96,同时在各孔添加10 µl的药物缓冲液。小分子药物实验最终浓度为10 µM,多肽为1 µM。
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