xCELLigence系统实时监测低毒性X-tremeGENE DNA转染
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前言
X-tremeGENE DNA Transfection Reagent是一种非脂质体、多组分转染试剂，已被证明可有效转染多种细胞。X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP在有无血清条件下均可进行转染，且细胞毒性低，转染后无需更换培养基。
降低转染试剂本身的脱靶效应是非常重要的：
· 在长时间内保证转染目标基因的高表达率
· 减少死细胞数目及其释放的蛋白酶，能高表达未被消化的目的重组蛋白。
· 获得同转染目标基因生物相关的结果
本研究中，在Hela细胞上进行了X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HPTransfection Reagent的细胞毒性和转染效率检测，并与其他试剂进行了比较。
步骤
· 细胞毒性使用xCELLigence RTCA MP仪器进行检测，通过测定电阻抗，可长时间、无标记、动态监控细胞生理活动，包括细胞黏附、伸展、增殖、死亡以及其他形态变化。新推出的配套耗材E-plate VIEW 96每个孔下部有0.5mm透明的窗口，可完成可视化的精微检查。
· 罗氏自动化图像捕获和分析系统Cellavista，其为结合可见光和荧光成像优点的全自动、高通量精微细胞图像分析工作站，在实验中观测细胞形态学变化和检测转染效率。
· 细胞代谢活动可由WST-1细胞增殖试剂盒分析检测，定量活性细胞的代谢活力。
结果
细胞毒性
· xCELLigence RTCA MP仪器的连续监测显示，使用X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent在Hela细胞上转染GFP表达质粒，与未处理对照组的细胞指数（Cell Index, CI）值是相似的（图1）。而其他试剂在转染5个小时后，细胞指数值有明显的下降，表明存在细胞毒性。
图1: 使用X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent及其争转染试剂在Hela细胞上转染GFP表达质粒后，xCELLigence 检测的细胞指数变化曲线图。
图2：Hela细胞转染后的形态。可见光图像由Cellavist仪器获得（10倍放大）
· Cellavist可视化检测细胞形态，转染24h后获得可见光成像图。X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP转染的Hela细胞呈现健康状态，而其他试剂组则存在大量死亡细胞（图2）。
· 终点法分析，转染约72h后通过细胞增殖试剂盒WST-1分析确定细胞活性（图3）。与X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent相比，其他试剂转染细胞后，显著降低代谢活力，显示出细胞毒性效应。
图3：比较罗氏X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP 与其试剂转染细胞后，细胞活力的百分比。WST-1试剂盒检测得出数值，并以X-tremeGENE 9组结果进行标准化。
转染效率
· 为获得X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent及其他试剂转染后，表达GFP的细胞数目，Cellavista在指定时间点记录荧光图像（图4）。并利用Cellavista图像分析软件，根据GFP阳性细胞面积（荧光图像）与总的细胞面积（相应的可见光图像，未显示）进行定量，数据参见图5。在观察过程中得出，X-tremeGENE试剂有更高的转染效率。
图4 ：X-tremeGENE Transfection Reagent转染的细胞表达大量GFP。转染48h后，Cellavista记录的细胞表达GFP的荧光图像（10倍放大）。
图5：GFP表达水平定量。Cellavista分析软件统计转染后24h、48h和72h后的转染效率百分数（以X-tremeGENE 9 Transfection Reagent转染24h后获得的值进行标准化）。
总结
X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP Transfection Reagent在Hela细胞系的检测实验上，表现出低细胞毒性和高DNA转染效率。xCELLigence RTCA MP也是理想的适合实时检测试剂特异性效应的仪器。
材料和方法
细胞培养
Hela细胞（ATCC）接种在合适的含附加成分的细胞培养基中，并在37℃，5%CO2 湿润环境下培养。细胞用胰蛋白酶消化、清洗并接种在E-Plate VIEW 96上。
转染
接种24小时后，分别用三种转染试剂X-tremeGENE 9、X-tremeGENE HP以及其他试剂（LTX和L2K），转染CMV启动子的GFP-pcDNA3.1质粒。转染根据指导手册说明，采用各说明书建议的最适DNA与转染试剂比例。所有实验重复三次。
实时细胞分析
xCELLigence RTCA MP仪器连续监测实验全程细胞状态（从细胞接种到转染后三天）。测定每孔50 μl 细胞培养基的值作为背景电阻抗。每孔最终体积调整至100 μl，密度为4000个Hela细胞。接种后，电阻抗以固定时间间隔被测定。细胞指数（CI）值以转染时进行标准化。
自动成像
Cellavista系统高通量显微镜可在实验过程中指定时间点进行操作。xCELLigence 系统测定可短暂暂停，E-Plate VIEW 96可转化进Cellavista系统中。通过10倍物镜可获得所有96孔板的可见光和荧光图像。转染效率可使用Cellavista软件分析获得。获取图像后，E-Plate VIEW 96返回xCELLigence RTCA MP仪器中，细胞电阻测定可重新开始。
WST-1 分析
细胞活性可使用WST-1细胞增殖试剂盒(罗氏应用科学)在实验终点测定（转染后72小时），参见操作说明。
