材料与仪器
指数生长的哺乳动物细胞培养物
脂染试剂 NaCl 枸橼酸钠 质粒 DNA 纯化闭环质粒 DNA 细胞生长培养基
试管 聚苯乙烯或聚丙烯试管 组织培养皿
脂染试剂 NaCl 枸橼酸钠 质粒 DNA 纯化闭环质粒 DNA 细胞生长培养基
试管 聚苯乙烯或聚丙烯试管 组织培养皿
步骤
材料
缓冲液与溶液
贮存溶液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。将贮存液稀释成适当浓度。
脂染试剂
NaCl(5mol/L)(选用）
用于稀释 DOGA。
枸橼酸钠（pH5.5,20 mmol/L) 含 150 mmol/LNaCl(选用）
DOGS 用作脂染试剂时，可用于代替灭菌水稀释质粒 DNA（Kichler et al.1998)。
核酸与寡核苷酸
质粒 DNA
如果是第一次用脂染或使用不熟悉的细胞系，应使用编码大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶或者绿色荧光蛋白的表达质粒（见第 17 章信息栏中的绿色荧光蛋白）。这些质粒可从几个生产商处购买（如，pCMV-SPORT-β-gal,Life Technologies 公司，pEGFP-F,CLOTECH 公司；见图 16-2,16-3)。
纯化闭环质粒 DNA 可用层析柱或按照第 1 章介绍的溴化乙锭-CsCl 梯度离心。
DNA 用水溶至 1ug/ul。
培养基
细胞生长培养基 [完全培养基，无血清培养基与（备选的）选择性培养基]
特殊设备
试管，聚苯乙烯或聚丙烯试管
DGTMA 会与聚丙烯发生非特异性结合，必须使用聚苯乙烯试管。
组织培养皿（60 mm)
本方法是按照使用 60 mm 细胞培养皿设计的，如果使用多孔平板、细胞瓶、或者不同直径的平皿，则应按比例改变细胞密度与试刑用量。见表 16-3。
附加试剂
本方法步骤 9 可能需要第 17 章方案 7 所列试剂。
细胞与组织
指数生长的哺乳动物细胞培养物
方法
1. 脂染前 24 h, 通过胰酶消化收集细胞，以 105 细胞/平皿的密度平铺细胞于 60 mm 组织培养皿上（或 5X104 细胞/35 mm 平皿)。加 5 ml 生长培养基（用 35 mm 平皿则加 3 ml)，于含 5%~7%CO2 的 37°C 温箱孵育 20~24 h。
转染时细胞应 75% 长满。如果转染前细胞生长不足 12 h, 细胞就不能很好地吸附在培养皿上，与脂类接触时易于脱落。
2. 用 100ul 灭菌去离子水（使用 Lipofectin 时）或含 150 mmol/LNaCl 的 20 mmol/L 枸橼酸钠（pH5.5)(使用 Transfectam 时）于聚苯乙烯或聚丙烯试管内稀释 1~10ug 质粒 DNA。在另一个试管内用灭菌去离子水或 300 mmol/LNaCl 将 2~50ul 脂溶液稀释至 100ul。
重要事项：用 Lipofectin 转染时，由于阳离子脂类 DOTMA 会与聚丙烯发生非待异性结合，故使用聚苯乙烯试管，不要用聚丙烯试管。至于其他阳离子脂类，根据生产商的推荐选择试管。
3. 室温下孵育 10 min。
4. 将脂溶液加入 DNA 中，用吸管吹打几次混匀，室溫下孵育 10 min。
5. 孵育 DNA-脂溶液时，用无血清培养基将要转染的细胞洗涤 3 次，然后于每一 60 mm 平皿中加入 0.5 ml 无血清培养基，将细胞再放入含 5%~7%CO2 的 37°C 温箱中孵育。
在加 DNA-脂溶液前，用无血淸培养基洗涤要转染的细胞非常重要有时候，血清会强力抑制转染（Felgner and Holm 1989)，同样，胞外基质复合物，如硫酸蛋白聚糖也会抑制转染，可能是通过结合 DNA-脂类而阻止受体细胞质膜与其发生相互作用。
6.DNA-脂溶液孵育 10min 后，于每一管内加入 900ul 无血清培养基。用吸管吹打几次混匀，室温下孵育 10 min。
7. 转移各管 DNA-脂溶液至 60 mm 平皿的细胞中，于含 5%~7%CO2 的 37°C 温箱中孵育 1~24 h。
8. 细胞在 DNA 中孵育适当时间后，用无血清培养基洗涤 3 次，加入完全培养基解育。
9. 如果是稳定转染细胞，继续进行步骤 10。脂染 24~96 h 后用下述方法之一检査细胞。
• 如果使用表达β-葡萄糖醛酸酶的质粒 DNA, 按照第 17 章方案 7 所述步骤检测细胞裂解液中酶的活性，或者依照附加方案：单层细胞组化染色鉴定β-葡萄糖醛酸酶所述通过组化染色检测。
• 如果使用表达绿色荧光蛋白的质粒 DNA, 在 450~490nm 光下用显微镜检査细胞。
• 如果使用其他基因产物为标志，可以通过体内代谢标志进行放射免疫、免疫印溃、免疫沉淀，或者分析细胞提取物中酶活性等方法分析新合成的蛋白。
为减小不同培养血之间转染效率的差异，最好 （1）. 用每一构建体转染数个培养皿；（2）. 孵育 24 h 后用胰酶消化细胞；（3）. 将细胞汇集起来；以及 （4）. 重铺细胞于几个培养皿上。
10. 分离稳定转染体：细胞在完全培养基中孵育 48~72 h 后，用胰酶消化细胞并用合适的选择培养基重铺细胞。每 2~4 天更换培养基，持续培养 2~3 周，目的是清除死细胞残骸，促进抗性细胞生长。这样，独立克隆便可以克隆、繁殖，以用于检测 (方法见 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b[《细胞实验手册》的第 86 章])。
用预冷的甲醇固定细胞 l5 min. 然后室温下用 10%Giemsa 染色 15 min, 流水冲洗，这样可以纪录细胞克隆数目。Giemsa 染液应是使用前用磷酸盐缓冲液或水新制备的，用 Whatman1 号滤纸过滤。
缓冲液与溶液
贮存溶液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。将贮存液稀释成适当浓度。
脂染试剂
NaCl(5mol/L)(选用）
用于稀释 DOGA。
枸橼酸钠（pH5.5,20 mmol/L) 含 150 mmol/LNaCl(选用）
DOGS 用作脂染试剂时，可用于代替灭菌水稀释质粒 DNA（Kichler et al.1998)。
核酸与寡核苷酸
质粒 DNA
如果是第一次用脂染或使用不熟悉的细胞系，应使用编码大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶或者绿色荧光蛋白的表达质粒（见第 17 章信息栏中的绿色荧光蛋白）。这些质粒可从几个生产商处购买（如，pCMV-SPORT-β-gal,Life Technologies 公司，pEGFP-F,CLOTECH 公司；见图 16-2,16-3)。
纯化闭环质粒 DNA 可用层析柱或按照第 1 章介绍的溴化乙锭-CsCl 梯度离心。
DNA 用水溶至 1ug/ul。
培养基
细胞生长培养基 [完全培养基，无血清培养基与（备选的）选择性培养基]
特殊设备
试管，聚苯乙烯或聚丙烯试管
DGTMA 会与聚丙烯发生非特异性结合，必须使用聚苯乙烯试管。
组织培养皿（60 mm)
本方法是按照使用 60 mm 细胞培养皿设计的，如果使用多孔平板、细胞瓶、或者不同直径的平皿，则应按比例改变细胞密度与试刑用量。见表 16-3。
附加试剂
本方法步骤 9 可能需要第 17 章方案 7 所列试剂。
细胞与组织
指数生长的哺乳动物细胞培养物
方法
1. 脂染前 24 h, 通过胰酶消化收集细胞，以 105 细胞/平皿的密度平铺细胞于 60 mm 组织培养皿上（或 5X104 细胞/35 mm 平皿)。加 5 ml 生长培养基（用 35 mm 平皿则加 3 ml)，于含 5%~7%CO2 的 37°C 温箱孵育 20~24 h。
转染时细胞应 75% 长满。如果转染前细胞生长不足 12 h, 细胞就不能很好地吸附在培养皿上，与脂类接触时易于脱落。
2. 用 100ul 灭菌去离子水（使用 Lipofectin 时）或含 150 mmol/LNaCl 的 20 mmol/L 枸橼酸钠（pH5.5)(使用 Transfectam 时）于聚苯乙烯或聚丙烯试管内稀释 1~10ug 质粒 DNA。在另一个试管内用灭菌去离子水或 300 mmol/LNaCl 将 2~50ul 脂溶液稀释至 100ul。
重要事项：用 Lipofectin 转染时，由于阳离子脂类 DOTMA 会与聚丙烯发生非待异性结合，故使用聚苯乙烯试管，不要用聚丙烯试管。至于其他阳离子脂类，根据生产商的推荐选择试管。
3. 室温下孵育 10 min。
4. 将脂溶液加入 DNA 中，用吸管吹打几次混匀，室溫下孵育 10 min。
5. 孵育 DNA-脂溶液时，用无血清培养基将要转染的细胞洗涤 3 次，然后于每一 60 mm 平皿中加入 0.5 ml 无血清培养基，将细胞再放入含 5%~7%CO2 的 37°C 温箱中孵育。
在加 DNA-脂溶液前，用无血淸培养基洗涤要转染的细胞非常重要有时候，血清会强力抑制转染（Felgner and Holm 1989)，同样，胞外基质复合物，如硫酸蛋白聚糖也会抑制转染，可能是通过结合 DNA-脂类而阻止受体细胞质膜与其发生相互作用。
6.DNA-脂溶液孵育 10min 后，于每一管内加入 900ul 无血清培养基。用吸管吹打几次混匀，室温下孵育 10 min。
7. 转移各管 DNA-脂溶液至 60 mm 平皿的细胞中，于含 5%~7%CO2 的 37°C 温箱中孵育 1~24 h。
8. 细胞在 DNA 中孵育适当时间后，用无血清培养基洗涤 3 次，加入完全培养基解育。
9. 如果是稳定转染细胞，继续进行步骤 10。脂染 24~96 h 后用下述方法之一检査细胞。
• 如果使用表达β-葡萄糖醛酸酶的质粒 DNA, 按照第 17 章方案 7 所述步骤检测细胞裂解液中酶的活性，或者依照附加方案：单层细胞组化染色鉴定β-葡萄糖醛酸酶所述通过组化染色检测。
• 如果使用表达绿色荧光蛋白的质粒 DNA, 在 450~490nm 光下用显微镜检査细胞。
• 如果使用其他基因产物为标志，可以通过体内代谢标志进行放射免疫、免疫印溃、免疫沉淀，或者分析细胞提取物中酶活性等方法分析新合成的蛋白。
为减小不同培养血之间转染效率的差异，最好 （1）. 用每一构建体转染数个培养皿；（2）. 孵育 24 h 后用胰酶消化细胞；（3）. 将细胞汇集起来；以及 （4）. 重铺细胞于几个培养皿上。
10. 分离稳定转染体：细胞在完全培养基中孵育 48~72 h 后，用胰酶消化细胞并用合适的选择培养基重铺细胞。每 2~4 天更换培养基，持续培养 2~3 周，目的是清除死细胞残骸，促进抗性细胞生长。这样，独立克隆便可以克隆、繁殖，以用于检测 (方法见 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b[《细胞实验手册》的第 86 章])。
用预冷的甲醇固定细胞 l5 min. 然后室温下用 10%Giemsa 染色 15 min, 流水冲洗，这样可以纪录细胞克隆数目。Giemsa 染液应是使用前用磷酸盐缓冲液或水新制备的，用 Whatman1 号滤纸过滤。
来源：丁香实验
