浅析染色质免疫沉淀（ChIP）技术在DNA与蛋白质相互作用研究中的重要性
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染色质免疫沉淀（ChIP）是研究蛋白质-DNA相互作用的一项强大技术，广泛用于多个领域的染色质相关蛋白的研究（如组蛋白及其异构体，转录因子等），特别适用于已知启动子序列或整个基因位点的组蛋白修饰分析研究。这项技术采用特定抗体来富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA片段，通过多种下游检测技术（定量PCR，芯片，测序等）来检测此富集片段的DNA序列。
ChIP技术自诞生之后，已成功的应用于人或动物细胞和组织 [1] 、植物组织 [2] 、酵母 [3] 以及细菌、质粒 [4] 。由于在信号转导和表观遗传研究中的突出作用，ChIP在肿瘤 [5-7] 、神经科学 [8-10] 、植物发育 [11-13] 等领域中应用非常广泛，同时有关细胞凋亡 [14] 、雌激素信号转导 [15] 、胰岛素抵抗 [16] 、组织发育 [1] 的文献中也用到ChIP。
目前，最常见的有以下两种ChIP实验技术：
1. nChIP：用来研究DNA及高结合力蛋白，采用微球菌核酸酶（micrococcal nuclease）消化染色质，然后进行片段富集及后续分析，适用于组蛋白及其异构体，例如 [17-19] ；
2. xChIP：用来研究DNA及低结合力蛋白，采用甲醛或紫外线进行DNA和蛋白交联，超声波片段化染色质，然后进行片段富集及后续分析，适用于多数非组蛋白的蛋白，例如 [9, 15, 20] 。
X-ChIP试验的一般过程
以上两种方法在分离DNA-蛋白质复合物之后，对DNA进行PCR扩增，验证目标序列的存在。除验证实验外，ChIP DNA也可以进行测序分析，这种方法被称为ChIP-seq [22] ；也可做芯片分析，这种方法被称为ChIP on CHIP或ChIP-CHIP [23] 。这两种方法都可用于分析感兴趣蛋白结合的未知序列，而不需要知道目标序列的详细信息，因此可以进行探索性的研究。当需要对DNA结合的蛋白复合物（两个或两个以上蛋白共同结合在DNA上）进行研究时，可以采用reChIP技术对DNA蛋白复合物进行再次富集，从而分析两种蛋白同时结合的DNA片段，例如转录调控因子及其受体复合物 [24] 。
相比其他DNA与蛋白相互作用的研究工具，ChIP的突出优势在于通过检测蛋白(in vivo)与DNA的物理结合，研究体内真实情况下的染色质结构，因此得出确凿的诱导或阻碍转录的证据，这对构架信号调控网络至关重要。同时，通过此工具也可以区分转录调控的直接作用和非直接作用 [21] ，从而使研究者对转录调控过程有更精确而深刻的认识。
ChIP试验的结果示例
基于上述的技术优势，ChIP首先被用来研究分子层面上的调控机制，区别于其他研究转录调控相关性的实验手段。这类分子机制研究多数是关注于DNA结合位点是否为启动子区或其他转录调控位点。例如，癌基因myc上游调控机制的研究非常之多，然而大多停留于假说阶段。Sotelo等人 [20] 于近期首先发现转录因子Tcf-4和β-catenin共同上调c-Myc基因调控因子enhance E的表达，然而luciferase reporter实验结果仅能证明β-catenin和转录因子Tcf-4与enhance E的相关性，无法提供证据表明这两种细胞因子如何作用于enhance E基因上。因此，他们采用了ChIP技术，证明前列腺癌LnCAP细胞中是Tcf-4而不是β-catenin直接结合到enhance E基因上，这就表明Tcf-4直接参与到enhance E的调控中。此结果与Hatzis等人 [25] 对直肠癌细胞系LS174T做的ChIP-CHIP测得的结果一致，证实了一直以来研究者关于myc存在远端增强子的猜测。类似地，有研究表明β-catenin与FGF2相互作用，影响神经干细胞增殖或分化，然而具体如何协同调控增殖或分化进程尚未知，直到Israsena等人[10]用ChIP试验证明了β-catenin仅在FGF2存在时与neurogenin启动子直接结合，从而调控FGF2下游信号通路。这就解释了FGF2在该信号通路中的主导作用。另一种常见的分子机制研究则是关注于DNA结合位点下游的基因，用此类基因的表达活化或抑制来解释表型上的差异。例如，Seo等人 [26] 采用ChIP技术分析了NeuroD结合位点的下游基因，发现了多个转录调控因子，因此得出结论，NeuroD则位于该神经发育调控网络的重要位置。
其次，ChIP也往往被用来验证其他DNA-蛋白质相互作用研究方法所得的结果。由于其他研究方法并非在体内(in vivo)实现或者尚不能得出确切结论，因此需要ChIP试验进行有力的支持。有研究 [6] 通过WB, MSP,EMSA等技术发现乳腺癌细胞的高度恶性与抑制肿瘤转移相关的TFPI-2基因启动子区过度甲基化有关，之后用ChIP试验则证实了该区域高度甲基化后确实转录水平因此受到影响，为上述的结论提供更充分的论据。类似的，Peng等人 [13] 用EMSA技术得出水稻转录因子OsLFL1结合于Ehd1基因的启动子区的初步结论后，采用ChIP在体内重复出了这个结果，因此最终能确定该转录因子的结合位置。
最后，ChIP是染色质结构改变，特别是组蛋白修饰后，研究全基因组活化或抑制作用的少数工具之一。ChIP可以针对乙酰化或者甲基化的组蛋白，富集该区域的DNA，因此可以进行基因组的多样性分析。2008年，Xiang等人 [7] 发现硒（Se）处理与前列腺癌细胞的DNA甲基化水平降低、组蛋白乙酰化水平升高、GSTP1（前列腺癌相关蛋白）活化有关。试验中，他们用ChIP技术富集了乙酰化H3-k9和甲基化H3-K9，对分离获得的DNA进行多个基因的PCR扩增。结果显示GSTP1基因在处理组和非处理组之间有显著差异，这表明Se处理的癌细胞GSTP1启动子相关的H3-K9乙酰化水平提高、H3-K3甲基化水平降低，预示Se可能具有调节染色质表观结构的功能。
正因为ChIP技术对于表观遗传学及信号转导研究是如此之重要，默克密理博特别为该领域的科学家们专门开发了的ChIP解决方案，其中完备的ChIP试剂盒免去提前准备各种试剂（包括鲑鱼精子DNA包被的琼脂糖珠子、Protein A/G等）的麻烦，专用的ChIP抗体节省了抗体测试的时间和精力，优化的protocol大大降低了ChIP实验的难度、减少摸索实验条件的时间。经过不断的改良及完善，新一代的EZ-ChIP能够提供阴性、阳性对照和DNA纯化柱，使ChIP试验更为高效可靠，大量经典文献的引用即是其品质的保证 [27-29] 。另外，对于应用越来越多的ChIP on CHIP，默克密理博还提供EZ-Magna ChIP试剂盒，磁珠分离技术让ChIP跨入高通量时代，为全基因组的探索插上翱翔的翅膀。
关于ChIP技术原理及实验方法， 请参考
染色质免疫沉淀（ChIP）技术的难点及应用(作者：柴晶晶博士)
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参考文献：
1. Zhang, Y., et al., GATA and Nkx factors synergistically regulate tissue-specific gene expression and development in vivo. Development, 2007. 134(1): p. 189-98.
2. Rossi, V., et al., A maize histone deacetylase and retinoblastoma-related protein physically interact and cooperate in repressing gene transcription. Plant Mol Biol , 2003. 51(3): p. 401-13.
3. Han, Q., et al., Gcn5- and Elp3-induced histone H3 acetylation regulates hsp70 gene transcription in yeast. Biochem J , 2008. 409(3): p. 779-88.
4. Grainger, D.C., et al., Genomic studies with Escherichia coli MelR protein: applications of chromatin immunoprecipitation and microarrays. J Bacteriol , 2004. 186(20): p. 6938-43.
5. Wu, C.H., et al., Combined analysis of murine and human microarrays and ChIP analysis reveals genes associated with the ability of MYC to maintain tumorigenesis. PLoS Genet, 2008. 4(6): p. e1000090.
6. Guo, H., et al., Tissue factor pathway inhibitor-2 was repressed by CpG hypermethylation through inhibition of KLF6 binding in highly invasive breast cancer cells. BMC Mol Biol , 2007. 8: p. 110.
7. Xiang, N., et al., Selenite reactivates silenced genes by modifying DNA methylation and histones in prostate cancer cells. Carcinogenesis , 2008. 29(11): p. 2175-81.
8. Sun, G., et al., Orphan nuclear receptor TLX recruits histone deacetylases to repress transcription and regulate neural stem cell proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A , 2007. 104(39): p. 15282-7.
9. Zhao, C., et al., A feedback regulatory loop involving microRNA-9 and nuclear receptor TLX in neural stem cell fate determination. Nat Struct Mol Biol , 2009. 16(4): p. 365-71.
10. Israsena, N., et al., The presence of FGF2 signaling determines whether beta-catenin exerts effects on proliferation or neuronal differentiation of neural stem cells. Dev Biol , 2004. 268(1): p. 220-31.
11. Kwon, C.S., C. Chen, and D. Wagner, WUSCHEL is a primary target for transcriptional regulation by SPLAYED in dynamic control of stem cell fate in Arabidopsis. Genes Dev , 2005. 19(8): p. 992-1003.
12. Rossi, V., et al., Maize histone deacetylase hda101 is involved in plant development, gene transcription, and sequence-specific modulation of histone modification of genes and repeats. Plant Cell , 2007. 19(4): p. 1145-62.
13. Peng, L.T., et al., Ectopic expression of OsLFL1 in rice represses Ehd1 by binding on its promoter. Biochem Biophys Res Commun , 2007. 360(1): p. 251-6.
14. Omata, K., et al., Identification and characterization of the human inhibitor of caspase-activated DNase gene promoter. Apoptosis , 2008. 13(7): p. 929-37.
15. Metivier, R., et al., Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell , 2003. 115(6): p. 751-63.
16. Shi, H., et al., TLR4 links innate immunity and fatty acid-induced insulin resistance. J Clin Invest , 2006. 116(11): p. 3015-25.
17. Tsukuda, T., et al., Chromatin remodelling at a DNA double-strand break site in Saccharomyces cerevisiae. Nature , 2005. 438(7066): p. 379-83.
18. Bernstein, B.E., et al., A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell , 2006. 125(2): p. 315-26.
19. Topp, C.N., C.X. Zhong, and R.K. Dawe, Centromere-encoded RNAs are integral components of the maize kinetochore. Proc Natl Acad Sci U S A , 2004. 101(45): p. 15986-91.
20. Sotelo, J., et al., Long-range enhancers on 8q24 regulate c-Myc. Proc Natl Acad Sci U S A , 2010. 107(7): p. 3001-5.
21. Weinmann, A.S., Novel ChIP-based strategies to uncover transcription factor target genes in the immune system. Nat Rev Immunol , 2004. 4(5): p. 381-6.
22. Barski, A. and K. Zhao, Genomic location analysis by ChIP-Seq. J Cell Biochem , 2009. 107(1): p. 11-8.
23. Kim, T.H., L.O. Barrera, and B. Ren, ChIP-chip for genome-wide analysis of protein binding in mammalian cells. Curr Protoc Mol Biol , 2007. Chapter 21: p. Unit 21 13.
24. Metzger, E., et al., LSD1 demethylates repressive histone marks to promote androgen-receptor-dependent transcription. Nature , 2005. 437(7057): p. 436-9.
25. Hatzis, P., et al., Genome-wide pattern of TCF7L2/TCF4 chromatin occupancy in colorectal cancer cells. Mol Cell Biol , 2008. 28(8): p. 2732-44.
26. Seo, S., et al., Neurogenin and NeuroD direct transcriptional targets and their regulatory enhancers. EMBO J , 2007. 26(24): p. 5093-108.
27. Loffler, D., et al., Interleukin-6 dependent survival of multiple myeloma cells involves the Stat3-mediated induction of microRNA-21 through a highly conserved enhancer. Blood , 2007. 110(4): p. 1330-3.
28. Kim, D.H., et al., MicroRNA-directed transcriptional gene silencing in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A , 2008. 105(42): p. 16230-5.
29. Borchert, G.M., W. Lanier, and B.L. Davidson, RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol , 2006. 13(12): p. 1097-101.
