实质等同性（转录组学）
丁香园
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1. 引言
在 21 世纪，如何养活不断膨胀的世界入口是一个主要挑战 [ 1 ] 。毫无疑问，转基因技术将对提髙作物产量和质量做出重要贡献。然而，由于公众在某种程度上对转基因技术安全存在担忧，因此，在西欧，转基因作物的接受程度很低。监管部门允许转基因作物商业化生产应用之前，也需要其详细的研究资料，包括证明它们与常规育种产生的作物是实质等同性的 [ 2 ] 。
虽然 “实质等同性”很难精确定义，但通常被认为是指在同样生长条件下转基因系的成分，应该与常规育种品系处于同一范围之内。
使用定制的 cDNA 芯片 [3~5 ] ，我们鉴定了转基因小麦和常规小麦之间的转录组实质等同性，这两种小麦由胚乳特异性启动子驱动，表达相同的高分子质量谷蛋白亚基基因。通过对这组数据的分析，首先鉴别出显著差异表达的基因（ P <0.05 ) ，然后从中挑取变化倍数大于临界值（1.5 ) 的基因。转基因系还表达了 bar 和 uidA 标记基因，并含有基因和质粒骨架序列 [ 6~8 ] 。因此，我们也比较了导入整个质粒，或者切除后仅包含高分子质量谷蛋白亚基基因 DNA 片段，以及仅含选择标记基因的转基因系 [ 5 ] ( 见注1)。结果表明所研究的转基因的表达，对麦粒发育期整个基因组的表达在统计上没有显著的影响，特别是在常规育种的姐妹株系（sibling lines ) 之间产生更大差异时，如显著表达差异基因数和倍数不同时，也无转基因表达显著影响的证据[ 5 ]。
这里叙述的方法都是为利用 cDNA 芯片系统而研发的。这类芯片仍然被广泛地使用，特别适用于小规模分析少量候选基因，通常称 “精品阵列”。然而，多数大规模基因表达研究现在仍使用 Affymetrix 寡聚核苷酸芯片，如小麦基因芯片覆盖的基因更广，重复性和稳定性更好。这里表述的许多方法，同样适用于寡聚核苷酸芯片系统，如 RNA 样品制备，也包含了特异的 GeneChip 表达分析。
2. 材料
2.1 植物材料
( 1 ) 常规品系： L88 - 31 [ 9 ] 、 L88 -18 [ 9 ] 和品种 Candenza (B 1084 -0-1) [ 5]。
( 2 ) L88-31 背景的转基因面包小麦：纯合株系是从 B102-1-1 挑选的 [ 6, 7 ] 。
( 3 ) 品种 Cadenza 背景的转基因面包小麦：无其他片段的转基因系 B1355-4-2( 18 ) 和整个质粒的转基因系B1118-8-4 (6) [ 5 ] 。
2.2 植物生长条件
( 1 ) 密闭玻璃房或者人工气候室维持白天 18~20℃、黑夜 10~14°C，光周期 16 h/8 h，光照强度 750 mE/ (s.m2) ，相对湿度 50%~70%。
( 2 ) 自动控制的浇水系统。
2.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 见 [ 10 ])
( 1 ) 分离胶缓冲液：1.25 mol/L Tris-borate，1% (m/V ) SDS，pH 6.8 ( 不需要调整）。
( 2 ) 浓缩缓冲液：1.0 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，10% ( m/V) SDS。
( 3 ) 10% ( m/V）过硫氨酸 （ 现配）。
( 4 ) 样品缓冲液：6.55 ml 浓缩缓冲液，pH 6.8，3.3% ( m/V ) SDS，10%（m/V）甘油和 1.54% (m/V) DTT ( 终浓度 100 mmol/L) 。加水定容至 100 ml。
( 5 ) 电泳缓冲液：10x 分离胶缓冲液。
( 6 ) 丙烯酰胺溶液：40% ( m/V ) 丙烯酰胺和 2% ( m/V ) 甲叉双丙烯酰胺。
2.4 总 RNA 提取（见注2)
2.4.1 小麦胚乳总 RNA 提取（ [ 11 ] )
( 1 ) 提取缓冲液：2% (m/V ) CTAB，2% (m/V) PVP , 100 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 )，25 mmol/L EDTA, 2.0 mol/L NaCl ( 见注 3 ) 。
( 2 ) β-巯基乙醇（见注4) 。
( 3 ) 氯仿：异戊醇（24 : 1 ) ( 见注4) 。
( 4 ) 10 mol/L LiCl。
( 5 ) SSTE 缓冲液：1.0 mol/L NaCl，0.5% SDS, 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 ) ，1 mmol/L EDTA。
2.4.2 小麦胚乳总 RNA 提取（[12 ])
( 1 ) 匀浆缓冲液（见注 5)：1.4% ( m/V ) SDS，0.1 mmol/L pH 8.0 乙酸钠，0.5 mol/L NaCl，0.05 mol/L EDTA ( pH 8.0 ) ，0.1%（m/V） β- 巯基乙醇。
( 2 ) Tris-HCl ( pH 8.0 )，溶解于酚/氯仿（1 :1，见注 6 ) 。
2.5 cDNA 芯片标记
( 1 ) cDNA 合成：0.5 | xg / (xl ( 70 ( Jimol /L ) oligo ( d T ) 23 描 定 引 物 （ Sigma- Genosis，Haverhill， U K ) ，逆转录酶HI (200U / m l ) 和 5x第一链合成缓冲液（ Imdtrogen， Paisley，U K ) ，5〇 Xaa-dNTP混 合 物 （ Sigma, 10 |xl d A T P 100 mmol/ L ，10 (xl d C T P 100 mmol/ L ，10 pi d G T P 100 mmol/ L ，5 fxl dTTP 100 mmol/ L , 5 pi 氨基烯丙基标记的 d U T P 100m m o l/ L ) 〇(2) aa-dUTP c D N A 纯化 ：微 型 洗 脱 柱 （ Qiagen, Crawley, U K ) ，75% ( V / V )乙醇。
( 3 ) 氨基婦丙基标记的第一链c D N A : Alexa染料號J 自酰亚胺酯（AlexaFluordye555/647，Molecular Probes) 备 用 （ 见注 7 ) ，1 mol/L p H 9 . 0 N a H C 0 3 标记缓冲液，微型洗脱柱 （ Qiagen， Crawley, U K ) 。
2 . 6 芯片杂交和洗脱
(1) 2x 杂交混合液 ： 400 ml50 % (m/V〇 甲酰胺， 450 mll0xSSC ，16ml0.2 %(m/ V) S D S ，2 m g/m l poly (d A ) 〇( 2 ) 洗 脱 室 （ 50 ml Falcon离心管）。
( 3 ) 溶液入[2乂33(： ，1 % ( 肌 / 7 ) 3 0 3 ，蒸 馏水定容至5〇1111 ] ，溶 液 8 [ 1 \ 8 8 ( ： ，0 .2% ( 爪/ F ) S D S , 蒸馏水定容至 50 m l ] ，溶液 C [0.1 x S S C ，0.2% (m / F ) S D S , 蒸溜水定容至50 m l ] 。
2 . 7 实时逆转录PCR
2 . 7 . 1 c D N A 合成
(1) SuperScript?HIRT and R N a s e O U T ? 。
(2) 2 x R T - 反应混合物（ Invitrogen ) : 2 . 5 m m o l / L oligo (d T )2。，2 . 5ng/ml随机引物(6 碱基），10 m m o l / L M g C l2， d N T P 。
2 . 7 . 2 实时逆转录P C R 反应：配方
( 1) S Y B R G r ee n I 染色液， Platirmm7 ^ D N A 聚 合 酶 （ 6 0 U /m l ) 。
(2) d N T P (400 mm o l/L d G T P ，400 m m o l/L d A T P ，400 mmol/L d C T P ，400 mm o l/Ld U T P ) 〇(3) 40 m m o l / L p H 8 . 4 Tris - H C l ，100 m m o l / L K C 1，6 mm o l/L MgCl2〇第 15章实质等同性 ： 转录组学 ? 207 ■(4) U D G (尿嘧啶D N A 糖基化酶4 0 U / m l ) 。
(5) R O X 参照染料 （ 甘氨酸结合的5- 羧基- X - 罗丹明，琥珀酰亚胺酯）。
4. 注释
注 1 : 数据提交。这里展示的基因表达数据已经递交到 ArmyExpress 数据库 ( http： //w w w . ebi . ac. uk/ arrayexpress / Submissions/ index. html) , 记录号是 A-MEXP-177。
注 2 : 除非另有说明，所有的化学溶液应是无核酸酶的。
注 3 : 提取液最好在室温下保存。高压灭菌后的提取液应该加入 0.5 g/L 亚精胺。β-巯基乙醇应该现配，加到分装的缓冲液。
注 4 : 使用试剂应谨慎，有毒、易燃或刺激性的试剂应在通风橱操作。
注 5 : 匀浆缓冲液应在使用前用各组分浓缩储存液现配。
注 6 : pH 8.0 Tris-HCl 缓冲的苯酚：氯仿（1 : 1 ) 的配制：将 800 ml 10 mmol/L pH 8.0 的 Tris-HCl , 小心加到400 g 超纯的苯酚晶体和 0.4 g 8-羟基喹啉（抗氧化剂）中。混合搅拌 1~2 h，然后静置分离。弃上层水相，下层黄色酚：氯仿层留用。如果保持黑黑暗，可以在室温下稳定的保存 1~2 个月。
注 7 : 将一小瓶 Alexa 染料溶于 2 ml 的二甲基亚砜（DMSO ) 。
注 8 : 用前将研钵、杵、药匙放入液氮中预冷并保持。
注 9 : 15 ml 提取液加 300 μl β-巯基乙醇置于 65°C 水浴加热。
注 10 : 准备第二套研钵、杵和一份缓冲液用于室温下匀浆。
注 11 : 如果匀浆太黏，多加些缓冲液（1~2 ml )。
注 12 : 加入乙酸钾（pH 5.5 ) 沉淀 K+- SDS/蛋白质/基因组 DNA/糖类的复合物。
注 13 : 要小心，保留的水层不要被沉淀、界面、变性蛋白质层的物质所污染。
注 14 : 氯化锂沉淀 RNA 的效率取决于核酸浓度，当 RNA 浓度降到 100 mg/ml 以下时，沉淀效率会突然显著性地下降。
注 15 : 用钾离子置换与纯化的 RNA 结合的残留锂离子。
注 16 : 对于纯化很好的 RNA，A260/A280 比值应为 2.0 左右，A260/A230 比值应 >1.8。浓度和纯度可以用NanoDrop ND 1000 分光光度计和 Agilent 2100 生物分析仪检测（http://www.agilent.com)。
注 17 : 另外，用于实时相对定量 RT-PCR 的 cDNA 可以用 SuperScriptlURT 和去 RNA 酶试剂盒 （ Invitrogen ) , 参照说明书合成。
注 18 : A A-dUTP 标记 cDNA 洗涤，添加 10 μl 无核酸酶水于迷你洗脱柱膜的中心，保持 5 min，离心 5 min。
注 19 : 将芯片置于 50 ml 锥形离心管，锡箔纸包裹。
注 20 : 在我们的研究中，数据分析采用了 GeneStar 系统，因为 GeneSpring 不适合对单基因建模检测其显著性，它建立的是所有基因的整体模型而不是基于基因对基因的。许多研究中数据标准化采用 GeneSpring 最方便。然而，由于我们的研究，进一步发展了 GeneStar 统计系统（第 8 章和第 9 章），允许用更复杂的方法对芯片数据建模。图像分析后的数据现在可以更简单地导入 GenStat，然后标准化和进一步地分析。而且，后续的和正在进行的研究表明不同的建模技术可以用于计算芯片上某区域点的空间变异 [29, 30 ]。另外，对标准化表达值层次混合建模 [ 31，32 ] 可以处理复杂变异数据，同时还能有功效检测到观测值少的基因的差异表达。最后，基因芯片的多重激光扫描分析 [ 33 ] 以及函数回归建模可能使得激光扫描高表达基因的噪声水平降低。
注 21 : 使用在这里讨论的建模方法检测了大量的基因，用拟合混合分布的基因P值来调查显著基因的假阳性率的方法 [ 34 ] 应该很有用，现在整合成了 GenStat 的 FDMI X TRE 组件。最后，有少量数据点每一个检测了大量基因的问题通过使用方差收缩的方法 [ 35 ] 可以得到缓解。这里使用了基因方差估计的检测方法，保留了基因特异性，又包含了基因之间的信息。这比单个基因检测更强大，但避免使用所有基因共同的最根本差异假设导致的假阳性率问题（ 与这里建模描述的那样）。
注 22 : 实验方案可以从网页下载 ：http:// w w w . affymetrix . com/ support / technical /manual/ netaffx _ M A G E _ M L _ manual, affx .
注 23 : 目前的技术参考见 http://www . affymetrix . com 。一张芯片上有多达 130 万不同的寡核苷酸“探针” （探针是芯片上合成的标准的 25 bp 寡核苷酸序列，可以在溶液中捕获互补目标）。每一个探针定位于特别的区域，称 为 “探针单元”。每个探针单元格中包含一个给定的核苷酸几十万到几百万之间的拷贝。“探针对”指的是 Affymetrix 芯片上基本的检测单元，由一对完美匹配（ PM ) 和相应错配 （MM) 的探针组成。芯片上一组探针对（“探针对”）代表选定的表达序列。
注 24 : TRIZOL - Reagent， Invitrogen 目录编号 15596-026。
注 25 : 按照 TRIZOL- Reagent RNA 提取步骤 1 匀浆，12000 g 离心 10 min 去除匀浆中的不溶性物质。
注 26 : 每 1 ml TRIZOL 试剂，水相中要依次加 0.25 ml 异丙醇（Sigma) 和 0.25 ml 高盐沉淀溶液（0.8 mol/L 柠檬酸钠和 1.2 mol/L NaCl) 来沉淀总 RNA。
注 27 : 按照说明书用 RNeasycolumn (Qiagen) 洗漆和浓缩总 RNA。
注 28 : 实验方案见基因芯片表达分析技术手册，第 1 章第 2 节。
注 29 : 实验方案见基因芯片表达分析技术手册，第 2 章第 2 节。
注 30 : 实验方案见基因芯片表达分析技术手册，第 3 章第 2 节第 7 部分。
注 31 : 参照基因芯片自动孵育装置用户操作指南。
注 32 : 实验方案见基因芯片表达分析技术手册（ 第 9 章第 2 节 “探针清洗和染色”和第 15 章探针芯片扫描）。查看扫描仪用户手册的安全防范措施和详细信息。
注 33 : 用于 SYBR 绿色荧光信号检测和挑选芯片差异表达基因（DEG ) 定量验证的特异引物对都是用 Primer Express 软件（ABITM PRSMA ) 按照 TaqMan 探针和引物设计指南设计的（EST 克隆序列在 http :// w w w . cerealsdb . uk. net / index. htm 检索 ）。
注 34 : 在分装到反应孔之前预先准备好主要混合物，包括足量的 cDNA 和反应成分，确保每一个反应含有等量 cDNA (即每个测试样品 3 次生物学重复，每个重复有 3 次技术重复），并可减少移液和其他错误。
注 35 : 为每一对特异性引物做解离曲线分析，检测是否有非特异性扩增发生。绘制了荧光信号（ DRJ 对循环数呈指数增长的基线消减点图（baseline-subtracted plot ) ,统计的多数基线数据的循环数为 3~15 个。
注 36 : 本研究中，内参基因 Actin （克隆号：H 01_ P 335_ plat _ 6; http://w w w .cerealsdb .uk. net / index.htm) 在不同株系、组织和发育阶段的表达没有差异。
注 37 : 可用数据：http :// www. ebi. ac. uk/ arrayexpress。
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虽然 “实质等同性”很难精确定义，但通常被认为是指在同样生长条件下转基因系的成分，应该与常规育种品系处于同一范围之内。
使用定制的 cDNA 芯片 [3~5 ] ，我们鉴定了转基因小麦和常规小麦之间的转录组实质等同性，这两种小麦由胚乳特异性启动子驱动，表达相同的高分子质量谷蛋白亚基基因。通过对这组数据的分析，首先鉴别出显著差异表达的基因（ P <0.05 ) ，然后从中挑取变化倍数大于临界值（1.5 ) 的基因。转基因系还表达了 bar 和 uidA 标记基因，并含有基因和质粒骨架序列 [ 6~8 ] 。因此，我们也比较了导入整个质粒，或者切除后仅包含高分子质量谷蛋白亚基基因 DNA 片段，以及仅含选择标记基因的转基因系 [ 5 ] ( 见注1)。结果表明所研究的转基因的表达，对麦粒发育期整个基因组的表达在统计上没有显著的影响，特别是在常规育种的姐妹株系（sibling lines ) 之间产生更大差异时，如显著表达差异基因数和倍数不同时，也无转基因表达显著影响的证据[ 5 ]。
这里叙述的方法都是为利用 cDNA 芯片系统而研发的。这类芯片仍然被广泛地使用，特别适用于小规模分析少量候选基因，通常称 “精品阵列”。然而，多数大规模基因表达研究现在仍使用 Affymetrix 寡聚核苷酸芯片，如小麦基因芯片覆盖的基因更广，重复性和稳定性更好。这里表述的许多方法，同样适用于寡聚核苷酸芯片系统，如 RNA 样品制备，也包含了特异的 GeneChip 表达分析。
2. 材料
2.1 植物材料
( 1 ) 常规品系： L88 - 31 [ 9 ] 、 L88 -18 [ 9 ] 和品种 Candenza (B 1084 -0-1) [ 5]。
( 2 ) L88-31 背景的转基因面包小麦：纯合株系是从 B102-1-1 挑选的 [ 6, 7 ] 。
( 3 ) 品种 Cadenza 背景的转基因面包小麦：无其他片段的转基因系 B1355-4-2( 18 ) 和整个质粒的转基因系B1118-8-4 (6) [ 5 ] 。
2.2 植物生长条件
( 1 ) 密闭玻璃房或者人工气候室维持白天 18~20℃、黑夜 10~14°C，光周期 16 h/8 h，光照强度 750 mE/ (s.m2) ，相对湿度 50%~70%。
( 2 ) 自动控制的浇水系统。
2.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 见 [ 10 ])
( 1 ) 分离胶缓冲液：1.25 mol/L Tris-borate，1% (m/V ) SDS，pH 6.8 ( 不需要调整）。
( 2 ) 浓缩缓冲液：1.0 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，10% ( m/V) SDS。
( 3 ) 10% ( m/V）过硫氨酸 （ 现配）。
( 4 ) 样品缓冲液：6.55 ml 浓缩缓冲液，pH 6.8，3.3% ( m/V ) SDS，10%（m/V）甘油和 1.54% (m/V) DTT ( 终浓度 100 mmol/L) 。加水定容至 100 ml。
( 5 ) 电泳缓冲液：10x 分离胶缓冲液。
( 6 ) 丙烯酰胺溶液：40% ( m/V ) 丙烯酰胺和 2% ( m/V ) 甲叉双丙烯酰胺。
2.4 总 RNA 提取（见注2)
2.4.1 小麦胚乳总 RNA 提取（ [ 11 ] )
( 1 ) 提取缓冲液：2% (m/V ) CTAB，2% (m/V) PVP , 100 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 )，25 mmol/L EDTA, 2.0 mol/L NaCl ( 见注 3 ) 。
( 2 ) β-巯基乙醇（见注4) 。
( 3 ) 氯仿：异戊醇（24 : 1 ) ( 见注4) 。
( 4 ) 10 mol/L LiCl。
( 5 ) SSTE 缓冲液：1.0 mol/L NaCl，0.5% SDS, 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 ) ，1 mmol/L EDTA。
2.4.2 小麦胚乳总 RNA 提取（[12 ])
( 1 ) 匀浆缓冲液（见注 5)：1.4% ( m/V ) SDS，0.1 mmol/L pH 8.0 乙酸钠，0.5 mol/L NaCl，0.05 mol/L EDTA ( pH 8.0 ) ，0.1%（m/V） β- 巯基乙醇。
( 2 ) Tris-HCl ( pH 8.0 )，溶解于酚/氯仿（1 :1，见注 6 ) 。
2.5 cDNA 芯片标记
( 1 ) cDNA 合成：0.5 | xg / (xl ( 70 ( Jimol /L ) oligo ( d T ) 23 描 定 引 物 （ Sigma- Genosis，Haverhill， U K ) ，逆转录酶HI (200U / m l ) 和 5x第一链合成缓冲液（ Imdtrogen， Paisley，U K ) ，5〇 Xaa-dNTP混 合 物 （ Sigma, 10 |xl d A T P 100 mmol/ L ，10 (xl d C T P 100 mmol/ L ，10 pi d G T P 100 mmol/ L ，5 fxl dTTP 100 mmol/ L , 5 pi 氨基烯丙基标记的 d U T P 100m m o l/ L ) 〇(2) aa-dUTP c D N A 纯化 ：微 型 洗 脱 柱 （ Qiagen, Crawley, U K ) ，75% ( V / V )乙醇。
( 3 ) 氨基婦丙基标记的第一链c D N A : Alexa染料號J 自酰亚胺酯（AlexaFluordye555/647，Molecular Probes) 备 用 （ 见注 7 ) ，1 mol/L p H 9 . 0 N a H C 0 3 标记缓冲液，微型洗脱柱 （ Qiagen， Crawley, U K ) 。
2 . 6 芯片杂交和洗脱
(1) 2x 杂交混合液 ： 400 ml50 % (m/V〇 甲酰胺， 450 mll0xSSC ，16ml0.2 %(m/ V) S D S ，2 m g/m l poly (d A ) 〇( 2 ) 洗 脱 室 （ 50 ml Falcon离心管）。
( 3 ) 溶液入[2乂33(： ，1 % ( 肌 / 7 ) 3 0 3 ，蒸 馏水定容至5〇1111 ] ，溶 液 8 [ 1 \ 8 8 ( ： ，0 .2% ( 爪/ F ) S D S , 蒸馏水定容至 50 m l ] ，溶液 C [0.1 x S S C ，0.2% (m / F ) S D S , 蒸溜水定容至50 m l ] 。
2 . 7 实时逆转录PCR
2 . 7 . 1 c D N A 合成
(1) SuperScript?HIRT and R N a s e O U T ? 。
(2) 2 x R T - 反应混合物（ Invitrogen ) : 2 . 5 m m o l / L oligo (d T )2。，2 . 5ng/ml随机引物(6 碱基），10 m m o l / L M g C l2， d N T P 。
2 . 7 . 2 实时逆转录P C R 反应：配方
( 1) S Y B R G r ee n I 染色液， Platirmm7 ^ D N A 聚 合 酶 （ 6 0 U /m l ) 。
(2) d N T P (400 mm o l/L d G T P ，400 m m o l/L d A T P ，400 mmol/L d C T P ，400 mm o l/Ld U T P ) 〇(3) 40 m m o l / L p H 8 . 4 Tris - H C l ，100 m m o l / L K C 1，6 mm o l/L MgCl2〇第 15章实质等同性 ： 转录组学 ? 207 ■(4) U D G (尿嘧啶D N A 糖基化酶4 0 U / m l ) 。
(5) R O X 参照染料 （ 甘氨酸结合的5- 羧基- X - 罗丹明，琥珀酰亚胺酯）。
4. 注释
注 1 : 数据提交。这里展示的基因表达数据已经递交到 ArmyExpress 数据库 ( http： //w w w . ebi . ac. uk/ arrayexpress / Submissions/ index. html) , 记录号是 A-MEXP-177。
注 2 : 除非另有说明，所有的化学溶液应是无核酸酶的。
注 3 : 提取液最好在室温下保存。高压灭菌后的提取液应该加入 0.5 g/L 亚精胺。β-巯基乙醇应该现配，加到分装的缓冲液。
注 4 : 使用试剂应谨慎，有毒、易燃或刺激性的试剂应在通风橱操作。
注 5 : 匀浆缓冲液应在使用前用各组分浓缩储存液现配。
注 6 : pH 8.0 Tris-HCl 缓冲的苯酚：氯仿（1 : 1 ) 的配制：将 800 ml 10 mmol/L pH 8.0 的 Tris-HCl , 小心加到400 g 超纯的苯酚晶体和 0.4 g 8-羟基喹啉（抗氧化剂）中。混合搅拌 1~2 h，然后静置分离。弃上层水相，下层黄色酚：氯仿层留用。如果保持黑黑暗，可以在室温下稳定的保存 1~2 个月。
注 7 : 将一小瓶 Alexa 染料溶于 2 ml 的二甲基亚砜（DMSO ) 。
注 8 : 用前将研钵、杵、药匙放入液氮中预冷并保持。
注 9 : 15 ml 提取液加 300 μl β-巯基乙醇置于 65°C 水浴加热。
注 10 : 准备第二套研钵、杵和一份缓冲液用于室温下匀浆。
注 11 : 如果匀浆太黏，多加些缓冲液（1~2 ml )。
注 12 : 加入乙酸钾（pH 5.5 ) 沉淀 K+- SDS/蛋白质/基因组 DNA/糖类的复合物。
注 13 : 要小心，保留的水层不要被沉淀、界面、变性蛋白质层的物质所污染。
注 14 : 氯化锂沉淀 RNA 的效率取决于核酸浓度，当 RNA 浓度降到 100 mg/ml 以下时，沉淀效率会突然显著性地下降。
注 15 : 用钾离子置换与纯化的 RNA 结合的残留锂离子。
注 16 : 对于纯化很好的 RNA，A260/A280 比值应为 2.0 左右，A260/A230 比值应 >1.8。浓度和纯度可以用NanoDrop ND 1000 分光光度计和 Agilent 2100 生物分析仪检测（http://www.agilent.com)。
注 17 : 另外，用于实时相对定量 RT-PCR 的 cDNA 可以用 SuperScriptlURT 和去 RNA 酶试剂盒 （ Invitrogen ) , 参照说明书合成。
注 18 : A A-dUTP 标记 cDNA 洗涤，添加 10 μl 无核酸酶水于迷你洗脱柱膜的中心，保持 5 min，离心 5 min。
注 19 : 将芯片置于 50 ml 锥形离心管，锡箔纸包裹。
注 20 : 在我们的研究中，数据分析采用了 GeneStar 系统，因为 GeneSpring 不适合对单基因建模检测其显著性，它建立的是所有基因的整体模型而不是基于基因对基因的。许多研究中数据标准化采用 GeneSpring 最方便。然而，由于我们的研究，进一步发展了 GeneStar 统计系统（第 8 章和第 9 章），允许用更复杂的方法对芯片数据建模。图像分析后的数据现在可以更简单地导入 GenStat，然后标准化和进一步地分析。而且，后续的和正在进行的研究表明不同的建模技术可以用于计算芯片上某区域点的空间变异 [29, 30 ]。另外，对标准化表达值层次混合建模 [ 31，32 ] 可以处理复杂变异数据，同时还能有功效检测到观测值少的基因的差异表达。最后，基因芯片的多重激光扫描分析 [ 33 ] 以及函数回归建模可能使得激光扫描高表达基因的噪声水平降低。
注 21 : 使用在这里讨论的建模方法检测了大量的基因，用拟合混合分布的基因P值来调查显著基因的假阳性率的方法 [ 34 ] 应该很有用，现在整合成了 GenStat 的 FDMI X TRE 组件。最后，有少量数据点每一个检测了大量基因的问题通过使用方差收缩的方法 [ 35 ] 可以得到缓解。这里使用了基因方差估计的检测方法，保留了基因特异性，又包含了基因之间的信息。这比单个基因检测更强大，但避免使用所有基因共同的最根本差异假设导致的假阳性率问题（ 与这里建模描述的那样）。
注 22 : 实验方案可以从网页下载 ：http:// w w w . affymetrix . com/ support / technical /manual/ netaffx _ M A G E _ M L _ manual, affx .
注 23 : 目前的技术参考见 http://www . affymetrix . com 。一张芯片上有多达 130 万不同的寡核苷酸“探针” （探针是芯片上合成的标准的 25 bp 寡核苷酸序列，可以在溶液中捕获互补目标）。每一个探针定位于特别的区域，称 为 “探针单元”。每个探针单元格中包含一个给定的核苷酸几十万到几百万之间的拷贝。“探针对”指的是 Affymetrix 芯片上基本的检测单元，由一对完美匹配（ PM ) 和相应错配 （MM) 的探针组成。芯片上一组探针对（“探针对”）代表选定的表达序列。
注 24 : TRIZOL - Reagent， Invitrogen 目录编号 15596-026。
注 25 : 按照 TRIZOL- Reagent RNA 提取步骤 1 匀浆，12000 g 离心 10 min 去除匀浆中的不溶性物质。
注 26 : 每 1 ml TRIZOL 试剂，水相中要依次加 0.25 ml 异丙醇（Sigma) 和 0.25 ml 高盐沉淀溶液（0.8 mol/L 柠檬酸钠和 1.2 mol/L NaCl) 来沉淀总 RNA。
注 27 : 按照说明书用 RNeasycolumn (Qiagen) 洗漆和浓缩总 RNA。
注 28 : 实验方案见基因芯片表达分析技术手册，第 1 章第 2 节。
注 29 : 实验方案见基因芯片表达分析技术手册，第 2 章第 2 节。
注 30 : 实验方案见基因芯片表达分析技术手册，第 3 章第 2 节第 7 部分。
注 31 : 参照基因芯片自动孵育装置用户操作指南。
注 32 : 实验方案见基因芯片表达分析技术手册（ 第 9 章第 2 节 “探针清洗和染色”和第 15 章探针芯片扫描）。查看扫描仪用户手册的安全防范措施和详细信息。
注 33 : 用于 SYBR 绿色荧光信号检测和挑选芯片差异表达基因（DEG ) 定量验证的特异引物对都是用 Primer Express 软件（ABITM PRSMA ) 按照 TaqMan 探针和引物设计指南设计的（EST 克隆序列在 http :// w w w . cerealsdb . uk. net / index. htm 检索 ）。
注 34 : 在分装到反应孔之前预先准备好主要混合物，包括足量的 cDNA 和反应成分，确保每一个反应含有等量 cDNA (即每个测试样品 3 次生物学重复，每个重复有 3 次技术重复），并可减少移液和其他错误。
注 35 : 为每一对特异性引物做解离曲线分析，检测是否有非特异性扩增发生。绘制了荧光信号（ DRJ 对循环数呈指数增长的基线消减点图（baseline-subtracted plot ) ,统计的多数基线数据的循环数为 3~15 个。
注 36 : 本研究中，内参基因 Actin （克隆号：H 01_ P 335_ plat _ 6; http://w w w .cerealsdb .uk. net / index.htm) 在不同株系、组织和发育阶段的表达没有差异。
注 37 : 可用数据：http :// www. ebi. ac. uk/ arrayexpress。
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