实质等同性（代谢组学）
丁香园
2547
1. 引言
在选择所期望品质的植物株系时，代谢物的定量和定性分析往往起一定作用。目前，植物代谢组学这一相对新的学科的进展，已大大扩展了我们进行广泛的代谢物研究的能力。这些数据连同表型、质量性状和其他“组学”数据已纳入范围更广的“系统学”方法。植物代谢组学技术可应用于转基因或非转基因的新作物的实质等同性研究，以及植物科学的其他相关领域，如品种培育、QTL 分析、病虫害抗性和功能基因组学。
监管当局关心的问题是，转基因可能引起代谢变化从而产生有害化合物。科研人员能预测及方便地检测转基因对于代谢的直接作用。然而，人们还存在对于转基因的间接影响的担忧，因为转基因可能失活内源基因，或产生新的活性酶并与不同底物接触，从而产生新的代谢物。
代谢组学分析方法是利用经典化学光谱学，如核磁共振（NMR ) 、质谱分析 ( MS ) ，并常结合气相、液相或毛细管电泳色谱分析系统。大部分代谢组学实验室配置了一些基于生物学应用的技术。这些技术可概括分为“定向”方法和 “非定向”方法 [ 1 ] ，都被用于转基因植物的实质等同性研究 [ 2~6 ] 。定向分析是对特定的化合物或化合物类别的分析，长期以来支撑着植物代谢工程的研究，以及自然资源采集和育种过程中的性状选择等领域。定向研究通常是相对低通量的，且预先需要样品清理过程。此外，它常包含特定的衍生化、色谱分离，以及对感兴趣物最佳应答的探测系统。相反，现代自动光谱分析仪采集高通量的样品数据，结合化学计量学计算方法，彻底创新了人们进行大规模非定向分析的能力，而无需纯化特定的化合物类型。这种技术尤其适用于筛选大量样本而不偏向特定代谢物，因而很适用于研究转基因引起的非预期效应和确定质量性状选择的生物标记。
[ 1H ] -NMR 筛选和直接输注电喷雾电离质谱 [ 2, 3, 7 ] 能提供初提物互补的指纹，应用这些技术是确立实质等同性的一个好的起点。如果用作大规模试验的一个部分，这种筛选可用来研究以环境变异为背景的代谢组的差异。随后，可用定向分析进一步研究初筛时发现的差异。本文介绍了我们开发的适用于研究田间小麦 [ 3 ] 的 [ 4 ] -NMR 指纹识别的详细操作过程 [ 7 ]，同时讨论了实验设计、取样、生物重复和技术重复的关键问题，并提供了 NMR 数据处理和多变量分析的详细指导。有关多变量分析应用和其他 NMR 数据模式匹配技术，Lindon 等 [ 8 ] 精彩的综述给出了更全面的指导。
2. 材料
( 1 ) Eppendorf 聚丙稀管，1.5 ml ( Eppendorf UK，Cambridge，UK )。
( 2 ) [ 1H ] - NMR 抽提剂，准备足量使整体批次中每个样本加 1 ml，包含 80% ( V/V ) 氧化氘（D2O，99.9% D，Goss Scientific , Great Baddow, Essex, UK ) 、20% 氘代甲醇（CD3OD，99.8% D，Goss Scientific ) 和 0.05% ( m/V) deuterotrimethylsilylpropionate (氘代三甲基硅焼基丙酸盐，d4 - TSP，Goss Scientific ) 。
( 3 ) 洁净、干燥的 5 mm 薄壁 NMR 管。
( 4 ) 现代 NMR 波谱仪，以 [ 1H ] 频率 400 MHz 最小值运行，使用专用 1H 探针和现代软件，具批处理和光谱编辑功能最为理想（我们使用的是 XWIN - NMR 和 AMIX，购自 Bmker Biospin, Rheinstetten , Germany)。
( 5 ) SIMCA - P 多变量统计软件（Umetrics, Umea , Sweden) 。其他类似的软件包有 Pirouette (Infometrix , Bothell , WA , USA ) 和 Spotfire (Spotfire Inc.， MA , USA ) 。
3. 注释
注 1 : 在植物代谢组学实验中，特别是那些涉及田间种植材料的实验，由于受环境影响，小区设计必须提供足够的生物学重复并随机化，从而减少小气候和土壤的影响。理想条件下，必须进行多点试验，并在多个生长季节重复。
注 2 : 植物材料的取样要谨慎地操作并做好记录，这点极其重要。代谢组是高度动态的，所有取样应在光照周期的同一时间进行，采集的组织要放入液氮中以阻止新陈代谢。最好在取样时就将植物或植物部分归并成样品池。处理前这些组织要保存在 -80°C 。本研究中，同一试验田的 350 株植株的谷粒用于磨制面粉。
注 3 : 样品标注应反映生物学特性，并标注株系、小区编号、处理、生物学重复和技术重复。在开始实验前仔细考虑这一点，以利于后续数据处理，特别是多变量分析。
注 4 : 在整个实验排序中，应随机排列分析样品和示踪样品，这有助于保证整个实验的质量。在数据分析阶段，技术重复要群集，示踪样品也一样。这些样品能用于评价提取过程的可重复性。
注 5 : 这一阶段，任何不能悬浮于溶剂中的物质，都会导致提取过程中更大的变异性。
注 6 : 我们发现热激步骤对于谷物和面粉提取物特别重要。即使溶剂为 20% 甲醇，诸如 α- 淀粉酶的水解酶仍具有活性。这将导致提取物中碳水化合物的组成随时间发生变化。样品阵列随机排列的技术重复所获得的 NMR 图谱中，这一变化明显可见。我们已证明 90℃/2 min 的热激反应能消除这一问题，同时 NMR 频谱也保持稳定。这一问题在冻干的绿色组织中不那么明显，但所有用水性溶剂进行代谢组学提取方法时最好结合热激。
注 7 : 在进行大型实验前应评估样品的稳定性。这可比较新鲜样品与几天后样品的 NMR 波谱来评估。这一重要步骤保证了在自动取样器采集数据前，样品保持稳定。按所述方法制备的小麦粉提取物，其样品能保持数天的稳定。
注 8 : WATERSUP 参数集设置是一个标准的 Brnker 参数集。利用弛豫衰减时间 5 s 残余的 HOD 信号通过预饱和被抑制。参数集可以修改，以设定所需扫描的数目和通用的溶剂，使这些设置不需要为每个单独的样品做校正。
注 9 : 在本方法中，NMR 波谱仪在 399.752 MHz 操作，并使用 5 mm 多核的宽带探针。
注 10 : 每个频谱由包含 32k 数据点的 1024 次扫描构成，谱宽为 4845 Hz。使用更高频场仪器时，扫描数可以减少。例如，600 MHz 和 5 mm 逆探针条件下，这些样品需要 128 次扫描得到类似的信噪比。
注 11: WATERSUP 参数集要求一个独立的程序来处理频谱。在自动操作中，频谱在应用指数窗口功能、采用 0.5 Hz 线加宽设置后，自动挡进行傅里叶转换。定向和基线校正的进行也在自动程序内。[1H]-NMR 化学位移以 x 轴上的 TSP-d ( 在 80. 00 ) 为参照。频谱在 y 轴上也根据最高峰（在这个方法中为 TSP ) 按比例缩放。
注 12 : 每个 NMR 波谱都覆盖在所有其他波谱上。当比较整个实验的数据文件时，很容易辨认出有问题数据的文件。明显的问题是峰宽过宽或数据峰位移动极端嘈杂。数据不一致的原因为样品没有锁定造成，线宽问题常常因劣质 NMR 管或电压尖峰引起的数据收集中断。但要注意的是，相对来说很少样品会确实产生劣质的数据。
注 13 : 对大型试验而言，最好在实验进行中对数据进行“质量评价”，在样品从 NMR 自动取样器中取出前，对任何需重新测定的样品马上进行操作。为避免重新测定样品所带来的混乱，应以原始数据集中的原有文件名运行，从而覆盖掉前面劣质的频谱数据。这能避免劣质的波谱数据进入下一阶段的分析，也能简化频谱选择过程。
注 14 : 极性溶剂提取磨碎小麦籽粒的提取物典型的 NMR 波谱图如图17 . 1 所示。与植物绿色组织提取物的频谱相比，该频谱相对简单，主要由碳水化合物和氨基酸信号构成。要评估提取方法的可重复性，同一生物样品重复分析的波谱可以被覆盖。图17 . 2 所示的是所期望优良的可重复性分析，以及作为对比的较差可重复性的频谱样品。
注 15 : 由于内标物加入到了初始溶剂混合物中，从而加入到每个组织样品，以内标物这一峰值来缩放，可以比较实验中所有频谱。
注 16 : 将被保存进波谱基部的有效波谱位于列表的顶端。使用对应该波谱的样品名。在保存有效波谱后，重要的一点是在输入列表的下一样品名之前，先关闭这一波谱。这一程序使所有数据集能以同样方式按比例缩放，只需要输入不同的样品名。若需要整个过程自动操作，可利用 NMR 数据收集使用的实验样品列表编写一个单独的子程序。对于小型实验集则无此必要。
注 17 : 在样品组织具可变性的数据集里（如水分或淀粉含量），按总强度缩放比按参考区域缩放有时候更有用。
注 18 : 建议的多变量分析的一系列步骤并不详尽。统计数据分析的方法依赖于所提出生物问题的性质。在许多情况下，一系列的数据模型需要建立。在所有情况下，多变量分析得出的发现可以通过使用 AMIX 检查原始的 NMR 数据库来检验。
注 19 : 当打开数据文件后，不要排除“空白或包含文本”行。这有助于样本分类和彩色编码生成图。
注 20 : 如果数据集的任意区域被移除，因数据点的数目可能不同，很难比较输出到文库的标准化合物。
注 21 : 对于一个好的模型，R2 和 Q2 值应尽可能接近 1。当 Q2 值开始下降时，应该不再有成分生成。
注 22 : PCA 模型中产生的分值是一种新变量，能总结 X 变量。PC1 和 PC2 的分值相互正交且彼此完全独立。PC1 的分值解释 X 空间的最大变量，继之以 PC2 等。因此 X 空间中，PC1 对比 PC2 的散点图是一个窗口，显示 X 观察值相互之间如何坐落。邻近相互之间观察值类似，远离彼此的观察值不同。这类图谱可以表现数据中异常值、群组、相似点和其他模式的可能存在。PCA 得分图的简单示范如图17 . 3 所示。该示例中的数据明显群集成 3 组。组 1 溢出至图谱的左手边，因此具有低的 PC1 值。这些样品非常不同于具有高 PC1 值的组 2 和组 3。组 2 的样品可以通过 PC2 与组 3 分离，因此组 2 的 PC2 值高于组 3。
注 23 : 载荷图描述的是 PCA 得分图中导致群分离的化学位移的差异。载荷图可以用二维散点图或折线图来代表。线图格式尤为有用，因为它类似于初始的 NMR 波谱，在正、负方向都有峰。来自小麦数据集的两个载荷图的示例如图 17.4 所示。PC1 载荷图描述 PCA 得分图在水平方向的分离。PC1 载荷图上的正峰代表的是位于得分图右手边的样品提高的化学位移强度。PC2 载荷图描述 PCA 得分图在垂直方向的分离。PC2 载荷图上的正峰代表的是位于得分图上部的样品提高的化学位移强度。这些总结在图 17.5 中。
参考文献
1. Sumner, L. W ., Mendes, P. and Dixon, R. (2003) Plant metabolomics ： large-scale phytochemistry in thefunctional genomics era. Phytochemistry 62, 817-836.
2. Catchpole, G. S ., Beckmann, M., Enot, D. P . , Mondhe, M., Zywicki, B ., Taylor, J . , Hardy, N .,Smith, A., King, R. D ., Kell, D. B., Fiehn, 0. and Draper, J. (2005) Hierarchical metabolomics demonstrates substantial compositional similarity between genetically modified and conventional potato crops. P. N.A. S. USA 102, 14458-14462.
3. Baker, J. M., Hawkins, N. D ., Ward, J. L ., Lovegrove, A., Napier, J. A., Shewry, P. R. and Beale, M.H. (2006) A metabolomic study of substantial equivalence of field-grown genetically modified wheat. PlantBiotech. J, 4 , 381-392.
4. Defemez, M., Gunning, Y. M., Parr, A. J . , Shephard, L. V. T ., Davies, H. V. and Colquhoun, I. J.
(200 4 ) NMR and HPLCUV profiling of potatoes with genetic modifications to metabolic pathways. J. Agric.C/iem. 5 2 ，6075-6085.
5. Manetti， C . ， Bianchetti， C . ， Casciani， L . ， Castro， C . ， Di Cocco， M. E . ， Miccheli， A . ， Motto, M .， Conti,F. (2006) A metabonomic study of transgenic maize (Zea mays) seeds revealed variations in osmolytes andbranched amino acids. J. Exp. Bot. 57, 2613-2625.
6. Le Gall, G ., Colquhoun, I. J . , Davis, A. L ., Collins, G. J. and Verhoeyen, M. E. (2003) Metabolite profiling of tomato ( Lycoperiscon esculentum) using 1 H NMR spectroscopy as a tool to detect potential unin-tended effects following a genetic modification . 上 C/iem. 5 1， 2 44 7-24 56.
7. Ward, J. L ., Harris, C., Lewis, J. and Beale, M. H. (2003) Assessment of 1 H-NMR spectroscopy andmultivariate analysis as a technique for metabolite fingerprinting of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry 62,9 49-957.
8. Lindon, J. C., Holmes, E. and Nicholson, J. K. (2001) Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance. Prog. Nucl. Magn. Res. 39, 1-40.
在选择所期望品质的植物株系时，代谢物的定量和定性分析往往起一定作用。目前，植物代谢组学这一相对新的学科的进展，已大大扩展了我们进行广泛的代谢物研究的能力。这些数据连同表型、质量性状和其他“组学”数据已纳入范围更广的“系统学”方法。植物代谢组学技术可应用于转基因或非转基因的新作物的实质等同性研究，以及植物科学的其他相关领域，如品种培育、QTL 分析、病虫害抗性和功能基因组学。
监管当局关心的问题是，转基因可能引起代谢变化从而产生有害化合物。科研人员能预测及方便地检测转基因对于代谢的直接作用。然而，人们还存在对于转基因的间接影响的担忧，因为转基因可能失活内源基因，或产生新的活性酶并与不同底物接触，从而产生新的代谢物。
代谢组学分析方法是利用经典化学光谱学，如核磁共振（NMR ) 、质谱分析 ( MS ) ，并常结合气相、液相或毛细管电泳色谱分析系统。大部分代谢组学实验室配置了一些基于生物学应用的技术。这些技术可概括分为“定向”方法和 “非定向”方法 [ 1 ] ，都被用于转基因植物的实质等同性研究 [ 2~6 ] 。定向分析是对特定的化合物或化合物类别的分析，长期以来支撑着植物代谢工程的研究，以及自然资源采集和育种过程中的性状选择等领域。定向研究通常是相对低通量的，且预先需要样品清理过程。此外，它常包含特定的衍生化、色谱分离，以及对感兴趣物最佳应答的探测系统。相反，现代自动光谱分析仪采集高通量的样品数据，结合化学计量学计算方法，彻底创新了人们进行大规模非定向分析的能力，而无需纯化特定的化合物类型。这种技术尤其适用于筛选大量样本而不偏向特定代谢物，因而很适用于研究转基因引起的非预期效应和确定质量性状选择的生物标记。
[ 1H ] -NMR 筛选和直接输注电喷雾电离质谱 [ 2, 3, 7 ] 能提供初提物互补的指纹，应用这些技术是确立实质等同性的一个好的起点。如果用作大规模试验的一个部分，这种筛选可用来研究以环境变异为背景的代谢组的差异。随后，可用定向分析进一步研究初筛时发现的差异。本文介绍了我们开发的适用于研究田间小麦 [ 3 ] 的 [ 4 ] -NMR 指纹识别的详细操作过程 [ 7 ]，同时讨论了实验设计、取样、生物重复和技术重复的关键问题，并提供了 NMR 数据处理和多变量分析的详细指导。有关多变量分析应用和其他 NMR 数据模式匹配技术，Lindon 等 [ 8 ] 精彩的综述给出了更全面的指导。
2. 材料
( 1 ) Eppendorf 聚丙稀管，1.5 ml ( Eppendorf UK，Cambridge，UK )。
( 2 ) [ 1H ] - NMR 抽提剂，准备足量使整体批次中每个样本加 1 ml，包含 80% ( V/V ) 氧化氘（D2O，99.9% D，Goss Scientific , Great Baddow, Essex, UK ) 、20% 氘代甲醇（CD3OD，99.8% D，Goss Scientific ) 和 0.05% ( m/V) deuterotrimethylsilylpropionate (氘代三甲基硅焼基丙酸盐，d4 - TSP，Goss Scientific ) 。
( 3 ) 洁净、干燥的 5 mm 薄壁 NMR 管。
( 4 ) 现代 NMR 波谱仪，以 [ 1H ] 频率 400 MHz 最小值运行，使用专用 1H 探针和现代软件，具批处理和光谱编辑功能最为理想（我们使用的是 XWIN - NMR 和 AMIX，购自 Bmker Biospin, Rheinstetten , Germany)。
( 5 ) SIMCA - P 多变量统计软件（Umetrics, Umea , Sweden) 。其他类似的软件包有 Pirouette (Infometrix , Bothell , WA , USA ) 和 Spotfire (Spotfire Inc.， MA , USA ) 。
3. 注释
注 1 : 在植物代谢组学实验中，特别是那些涉及田间种植材料的实验，由于受环境影响，小区设计必须提供足够的生物学重复并随机化，从而减少小气候和土壤的影响。理想条件下，必须进行多点试验，并在多个生长季节重复。
注 2 : 植物材料的取样要谨慎地操作并做好记录，这点极其重要。代谢组是高度动态的，所有取样应在光照周期的同一时间进行，采集的组织要放入液氮中以阻止新陈代谢。最好在取样时就将植物或植物部分归并成样品池。处理前这些组织要保存在 -80°C 。本研究中，同一试验田的 350 株植株的谷粒用于磨制面粉。
注 3 : 样品标注应反映生物学特性，并标注株系、小区编号、处理、生物学重复和技术重复。在开始实验前仔细考虑这一点，以利于后续数据处理，特别是多变量分析。
注 4 : 在整个实验排序中，应随机排列分析样品和示踪样品，这有助于保证整个实验的质量。在数据分析阶段，技术重复要群集，示踪样品也一样。这些样品能用于评价提取过程的可重复性。
注 5 : 这一阶段，任何不能悬浮于溶剂中的物质，都会导致提取过程中更大的变异性。
注 6 : 我们发现热激步骤对于谷物和面粉提取物特别重要。即使溶剂为 20% 甲醇，诸如 α- 淀粉酶的水解酶仍具有活性。这将导致提取物中碳水化合物的组成随时间发生变化。样品阵列随机排列的技术重复所获得的 NMR 图谱中，这一变化明显可见。我们已证明 90℃/2 min 的热激反应能消除这一问题，同时 NMR 频谱也保持稳定。这一问题在冻干的绿色组织中不那么明显，但所有用水性溶剂进行代谢组学提取方法时最好结合热激。
注 7 : 在进行大型实验前应评估样品的稳定性。这可比较新鲜样品与几天后样品的 NMR 波谱来评估。这一重要步骤保证了在自动取样器采集数据前，样品保持稳定。按所述方法制备的小麦粉提取物，其样品能保持数天的稳定。
注 8 : WATERSUP 参数集设置是一个标准的 Brnker 参数集。利用弛豫衰减时间 5 s 残余的 HOD 信号通过预饱和被抑制。参数集可以修改，以设定所需扫描的数目和通用的溶剂，使这些设置不需要为每个单独的样品做校正。
注 9 : 在本方法中，NMR 波谱仪在 399.752 MHz 操作，并使用 5 mm 多核的宽带探针。
注 10 : 每个频谱由包含 32k 数据点的 1024 次扫描构成，谱宽为 4845 Hz。使用更高频场仪器时，扫描数可以减少。例如，600 MHz 和 5 mm 逆探针条件下，这些样品需要 128 次扫描得到类似的信噪比。
注 11: WATERSUP 参数集要求一个独立的程序来处理频谱。在自动操作中，频谱在应用指数窗口功能、采用 0.5 Hz 线加宽设置后，自动挡进行傅里叶转换。定向和基线校正的进行也在自动程序内。[1H]-NMR 化学位移以 x 轴上的 TSP-d ( 在 80. 00 ) 为参照。频谱在 y 轴上也根据最高峰（在这个方法中为 TSP ) 按比例缩放。
注 12 : 每个 NMR 波谱都覆盖在所有其他波谱上。当比较整个实验的数据文件时，很容易辨认出有问题数据的文件。明显的问题是峰宽过宽或数据峰位移动极端嘈杂。数据不一致的原因为样品没有锁定造成，线宽问题常常因劣质 NMR 管或电压尖峰引起的数据收集中断。但要注意的是，相对来说很少样品会确实产生劣质的数据。
注 13 : 对大型试验而言，最好在实验进行中对数据进行“质量评价”，在样品从 NMR 自动取样器中取出前，对任何需重新测定的样品马上进行操作。为避免重新测定样品所带来的混乱，应以原始数据集中的原有文件名运行，从而覆盖掉前面劣质的频谱数据。这能避免劣质的波谱数据进入下一阶段的分析，也能简化频谱选择过程。
注 14 : 极性溶剂提取磨碎小麦籽粒的提取物典型的 NMR 波谱图如图17 . 1 所示。与植物绿色组织提取物的频谱相比，该频谱相对简单，主要由碳水化合物和氨基酸信号构成。要评估提取方法的可重复性，同一生物样品重复分析的波谱可以被覆盖。图17 . 2 所示的是所期望优良的可重复性分析，以及作为对比的较差可重复性的频谱样品。
注 15 : 由于内标物加入到了初始溶剂混合物中，从而加入到每个组织样品，以内标物这一峰值来缩放，可以比较实验中所有频谱。
注 16 : 将被保存进波谱基部的有效波谱位于列表的顶端。使用对应该波谱的样品名。在保存有效波谱后，重要的一点是在输入列表的下一样品名之前，先关闭这一波谱。这一程序使所有数据集能以同样方式按比例缩放，只需要输入不同的样品名。若需要整个过程自动操作，可利用 NMR 数据收集使用的实验样品列表编写一个单独的子程序。对于小型实验集则无此必要。
注 17 : 在样品组织具可变性的数据集里（如水分或淀粉含量），按总强度缩放比按参考区域缩放有时候更有用。
注 18 : 建议的多变量分析的一系列步骤并不详尽。统计数据分析的方法依赖于所提出生物问题的性质。在许多情况下，一系列的数据模型需要建立。在所有情况下，多变量分析得出的发现可以通过使用 AMIX 检查原始的 NMR 数据库来检验。
注 19 : 当打开数据文件后，不要排除“空白或包含文本”行。这有助于样本分类和彩色编码生成图。
注 20 : 如果数据集的任意区域被移除，因数据点的数目可能不同，很难比较输出到文库的标准化合物。
注 21 : 对于一个好的模型，R2 和 Q2 值应尽可能接近 1。当 Q2 值开始下降时，应该不再有成分生成。
注 22 : PCA 模型中产生的分值是一种新变量，能总结 X 变量。PC1 和 PC2 的分值相互正交且彼此完全独立。PC1 的分值解释 X 空间的最大变量，继之以 PC2 等。因此 X 空间中，PC1 对比 PC2 的散点图是一个窗口，显示 X 观察值相互之间如何坐落。邻近相互之间观察值类似，远离彼此的观察值不同。这类图谱可以表现数据中异常值、群组、相似点和其他模式的可能存在。PCA 得分图的简单示范如图17 . 3 所示。该示例中的数据明显群集成 3 组。组 1 溢出至图谱的左手边，因此具有低的 PC1 值。这些样品非常不同于具有高 PC1 值的组 2 和组 3。组 2 的样品可以通过 PC2 与组 3 分离，因此组 2 的 PC2 值高于组 3。
注 23 : 载荷图描述的是 PCA 得分图中导致群分离的化学位移的差异。载荷图可以用二维散点图或折线图来代表。线图格式尤为有用，因为它类似于初始的 NMR 波谱，在正、负方向都有峰。来自小麦数据集的两个载荷图的示例如图 17.4 所示。PC1 载荷图描述 PCA 得分图在水平方向的分离。PC1 载荷图上的正峰代表的是位于得分图右手边的样品提高的化学位移强度。PC2 载荷图描述 PCA 得分图在垂直方向的分离。PC2 载荷图上的正峰代表的是位于得分图上部的样品提高的化学位移强度。这些总结在图 17.5 中。
参考文献
1. Sumner, L. W ., Mendes, P. and Dixon, R. (2003) Plant metabolomics ： large-scale phytochemistry in thefunctional genomics era. Phytochemistry 62, 817-836.
2. Catchpole, G. S ., Beckmann, M., Enot, D. P . , Mondhe, M., Zywicki, B ., Taylor, J . , Hardy, N .,Smith, A., King, R. D ., Kell, D. B., Fiehn, 0. and Draper, J. (2005) Hierarchical metabolomics demonstrates substantial compositional similarity between genetically modified and conventional potato crops. P. N.A. S. USA 102, 14458-14462.
3. Baker, J. M., Hawkins, N. D ., Ward, J. L ., Lovegrove, A., Napier, J. A., Shewry, P. R. and Beale, M.H. (2006) A metabolomic study of substantial equivalence of field-grown genetically modified wheat. PlantBiotech. J, 4 , 381-392.
4. Defemez, M., Gunning, Y. M., Parr, A. J . , Shephard, L. V. T ., Davies, H. V. and Colquhoun, I. J.
(200 4 ) NMR and HPLCUV profiling of potatoes with genetic modifications to metabolic pathways. J. Agric.C/iem. 5 2 ，6075-6085.
5. Manetti， C . ， Bianchetti， C . ， Casciani， L . ， Castro， C . ， Di Cocco， M. E . ， Miccheli， A . ， Motto, M .， Conti,F. (2006) A metabonomic study of transgenic maize (Zea mays) seeds revealed variations in osmolytes andbranched amino acids. J. Exp. Bot. 57, 2613-2625.
6. Le Gall, G ., Colquhoun, I. J . , Davis, A. L ., Collins, G. J. and Verhoeyen, M. E. (2003) Metabolite profiling of tomato ( Lycoperiscon esculentum) using 1 H NMR spectroscopy as a tool to detect potential unin-tended effects following a genetic modification . 上 C/iem. 5 1， 2 44 7-24 56.
7. Ward, J. L ., Harris, C., Lewis, J. and Beale, M. H. (2003) Assessment of 1 H-NMR spectroscopy andmultivariate analysis as a technique for metabolite fingerprinting of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry 62,9 49-957.
8. Lindon, J. C., Holmes, E. and Nicholson, J. K. (2001) Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance. Prog. Nucl. Magn. Res. 39, 1-40.
