材料与仪器
小麦
β-巯基乙醇 氯仿 异戊醇 SSTE 缓冲液
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
β-巯基乙醇 氯仿 异戊醇 SSTE 缓冲液
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
步骤
3.1 芯片背景
我们使用了 19846 个点，包含 9246 个 Unigene 序列的小麦 cDNA 芯片（http://www . cerealsdb. uk. net/index. htm) 用于详细的转录组研究 [3 ] 。重复的 unigene 集合阵列点到了 Codelink 活化芯片上（Amersham Biosciences Ltd, UK ) 。
芯片杂交用与 aa- dUTP- cDNA 样品荧光标记染料反向的染料——Alexa 荧光染料 555 和 647。杂交在转基因系 （B 102-1- 1、B1118-8-4 或 B1355-4-2 ) 和其原始非转基因系 ( L 88-31 或 Cadenza ) 之间的两个胚乳发育阶段（开花后 14 天和 28 天，dpa ) 和叶片 ( 发芽后 8 天，dpg ) 成对比较 [5]。每个材料取样 3 次，检测 2 次。
cDNA 芯片的优势是经济实惠，并允许使用者完全控制内容和设计（定制芯片）。相反，Affymetrix 寡核苷酸芯片更加灵活，它是单染料系统，使试验更简单、更特异(提高对类似的异构体和多基因家族成员的识别能力），提供更量化和易比较的数据。GeneCMp 基因组芯片，采用了一套能匹配任何转录序列的 25 碱基寡核苷酸“探针”。以小麦芯片为例，每组探针有 11 个，多数与组装的序列表达标签（ EST ) 的公共保守域序列一致。因此，在 cDNA 芯片中，每一组探针对应的是许多 EST，而不是单个的 EST。为了识别不同的转录本，同时满足其他条件，如 GC 含量相对一致，探针通过程序自动化设计。对于一个目标转录本，设计了 一个完全匹配的探针（perfect matches，PM ) 、一个单碱基错配探针（mismatches，MM ) ，这样能对非特异杂交有一个估计和矫正。然而，对于 MM 探针的真正信号值存在争论，许多广泛使用的分析方法不用 MM 探针（ 见 3.10节）。短 探针（ 如 25-mer) 对于序列相似的转录本更有效，因为单个碱基错配足够使杂交不稳定，而且固定长度使得杂交条件可以标准化，以满足所有探针；相反，较长的可变长度的探针，比如那些 cDNA 芯片平台使用的探针，将不可避免与任何与其部分序列相似性探针杂交，所以其真实信号集成了几个不同的转录分子。
3.2 植物材料和生长条件
转录组比较研究使用了三个六倍体转基因面包小麦的胚乳和叶片。转基因小麦品系 B102 -1-1 ( L 88-31 背景） [ 6, 7 ] 和 B1118-8-4 ( Cadenz 北背景）[ 5 ] 由基因枪共转化两个质粒产生[ 14 ] 。一个质粒是 p1Axl 质粒 [ 13 ] ，含有由自身的胚乳特异启动子驱动的高分子质量谷蛋白亚基 1AX1 ( Glu-M ) 基因； 另一个质粒含有选择基因bar 和标记基因 uidA，由玉米泛素启动子驱动。转基因系 B1355-4-2 [ 5 ] 也来自 Cadenza，共转化获得只含 IAX1 基因和 bar 基因编码序列的“干净”片段。一个常规育种系 L88-18 [ 9 ] 是 L88- 31 的姐妹系，也用于转录组比较。两个常规育种系 ( L 88-31、L 88-18 ) 和转基因系（B 102-1-1 ) 的转录组两两比较是：B 102-1-1与 L 88-31、L 88-18与 L 88-31、 B 102-1-1与 L 88-18。转化方法的比较，即 “干净”片段与整个质粒的比较：B1355-4-2 与 Cadenza、 B1118-8-4 与 Cadenza、 B1355-4-2 与 B1118-8-4。本研究所用的不同面包小麦携带的相关基因成分的详细信息见表15 . 1 。
( 1 ) 植物种在平衡行列设计的盆钵中，每个处理（小麦生长发育阶段）有 3 个生物学重复。
( 2 ) 开花后 14 天和 28 天胚乳，取样的植物每盆种 2 株。每一株只保留 2 个分蘖。选中的盆钵（本试验为 3 个生物学重复）包括用于发芽后第 8 天取叶片的第三株植物。
( 3 ) 每天观察穗，一旦发现中央小穗开花就做标记。
( 4 ) 在无菌条件下，手工从颖果剥离种子胚乳；每盆只从 2 个穗子的中部分别取至少 24 枚胚乳为一个样品。
( 5 ) 样品都是一天中同一时间取样，以避免昼夜节律的影响。
3.3 SDS-PAGE
通过谷粒总蛋白 SDS-PAGE 凝胶电泳，检测所有小麦系的高分子质量亚基蛋白的表达（图 15. 1 ) ，使用 10% ( m/V) 丙烯酰胺凝胶和 Tris-硼酸缓冲液系统 [ 10 ] 。
3.4 RNA 提取
3.4.1 小麦胚乳总 RNA 提取
提取方法根据 Chang 等 [ 11 ] 改编而来。
( 1 ) 用预冷的研钵和杵（-70°C ) 在液氮里将 2~3 g 组织磨成粉末（见注 8 ) 。
( 2 ) 室温下迅速将磨碎组织转移到有 15 ml 提取缓冲液（加入 300 μl β-巯基乙醇 ) 的离心管中，充分颠倒混匀（ 见注9) 。
( 3 ) 用等体积氯仿：异戊醇（终体积 15 ml ) 抽提两次，液相分离用 15000 g 室温离心 10 min。
( 4 ) 上清液加 0.25 倍体积 10 moI/L LiCl 混匀。4℃ 过夜沉淀 RNA，4℃、15000 g，离心 20 min 获取 RNA。
( 5 ) 500 ml SSTE 悬浮沉淀颗粒。
( 6 ) 用等体积氯仿：异戊醇抽提一次。
( 7 ) 上清液加两倍体积乙醇，-70℃ 沉淀 30 min 以上或者 -20℃ 沉淀 2 h。
( 8 ) 15000 g 离心 20 min 沉淀 RNA。
( 9 ) 75% 乙醇洗涤。
( 10 ) 干燥沉淀并溶解于无核酸降解酶水中。
3.4.2 发芽后 8 天幼苗 RNA 提取
提取方法根据 Cheng 等 [ 12 ] 改编而来。
( 1 ) 用预冷的研钵和杵（-70℃ ) 加液氮里将已知质量组织（大约 1 g 幼叶）磨成粉末（见注9) 。
( 2 ) 将冷冻的粉末快速转移到第二个有 10~15 ml 匀浆缓冲液的研钵中（见注10)，继续研磨至均匀（见注 11)。
( 3 ) 匀浆液转移到 50 ml 带帽的圆底旋盖离心管中，60℃ 孵育 10 min ( 匀浆液终体积 5~10 ml )。
( 4 ) 离心管置冰上冷却，加 0.2 倍体积 pH 5.5 的 5 mol/L 乙酸钾（见注 12) ，轻轻地充分混匀，然后冰上静置 10~15 min。
( 5 ) 10000 g、4℃ 离心 15 min , 取上清液到新的离心管中。
( 6 ) 加等体积酚：氯仿（1 : 1，V/V ) 混匀，拧紧瓶盖并剧烈振荡 10 min。10000 g、21°C 离心 10 min。取上层水相于新离心管中（见注13)。
( 7 ) 水相重复上一步的酚：氯仿萃取和分层。
( 8 ) 往水相加 0~1 倍体积 3 mol/L pH 5.3 乙酸钠和 2.5 倍体积乙醇。混匀后 -20℃ 孵育过夜以提高核酸沉淀效率。
( 9 ) 10000 g 、4℃ 离心 30 min 沉淀核酸，弃上清。倒置离心管数分钟。
( 10 ) 少量无核酸降解酶水（ 300~700 μl ) 溶解沉淀。核酸溶液转移到 Eppendorf 管，加 0.67 倍体积 10 mol/L 氯化锂沉淀 RNA。拌匀，冰上孵育 20~30 min ( 见注14)。
( 11 ) 离心（15000 g，室温，20 min ) 沉淀 RNA，弃上清。
( 12 ) 用尽可能小体积（ 200~300 μl) 的无核酸酶水溶解沉淀，重复氯化锂沉淀，和上一步同样离心沉淀 RNA。
(13 ) 200 μl 无核酸酶水溶解沉淀，加入 15 μl 5 mol/L 乙酸钾（pH 5.5 ) 和 800 μl 乙醇。混匀，离心（15000 g 室温，20 min) 沉淀 RNA ( 见注15)。
( 14 ) 弃上清，加入 1.0 ml 80% ( V/V ) 乙醇，离心洗涤 RNA ( 15000 g，室温，10 min)。
( 15 ) 离心管开盖置于超净工作台，室温干燥沉淀不超过 10 min。溶解于 100~200 μl 无核酸酶水中。将每份样品分成等量小份以避免在反复冻融过程中污染或者降解。
3.4.3 总 RNA 样品除去基因组 DNA
RNA 提取之后用 DNA-free ( DNA 酶处理和清除试剂盒，Ambion) 按照使用说明处理 RNA 片段。该系统专为去除 RNA 样品中的 DNA 杂质和清除处理后的 DNA 降解酶 I，无需加热或苯酚提取。
3.4.4 RNA 定量分析和质量控制
RNA 浓度、完整性及质量检测使用 Nanodrop ND 1000 分光光度计（Labtech Int ,U K ) 和 Agilent 2100 生物分析仪 ( RNA 6000 Nano Assay, Agilent Technologies, PaloAlto, CA，USA ) ( 见注 16)。
3.4.5 样品保存
RNA 样品短期（最长 3 个月）保存在 -20℃，长期则在 -80℃。
3.5 cDNA 合成
( 1 ) 加 100 μg DNA 酶处理过的总 RNA ( 不超过 20 μl) 、8 μl oligo (dT)23 锚定引物和无核酸酶水至终体积 28 μl。
( 2 ) 将启动反应混合物在 70℃ 孵育 10 min，置于冰上 5 min。
( 3 ) 向启动反应混合物加入 cDNA 合成反应混合物：10 μl 5x 第一链缓冲液，10 μl 0.1 mol/L DTT，5 μl 50x aa-dNTP 混合物，2 μl Superscript 逆转录酶Ⅲ（ 200 U/L ) ，加无核酸酶水至终体积 50 μl。
( 4 ) 42℃ 孵育 2~3 h。
( 5 ) 用微型离心柱（Qiagen) 参照使用说明纯化 aa-dUTP-dDNA 产物。
( 6 ) 收集最后的洗脱液 10 μl 作为样品。cDNA 的产品将用于准备芯片杂交的探针和实时 RT- PCR 技术。最后反应可不用 50x aa-dNTP 混合物进行（见注 17)。
3.6 cDNA 芯片标记
( 1 ) 为了 cDNA 与突光染料偶联反应，将需要反向染料标记的总 cDNA ( 见第3.5节步骤6 ) 分成两等份（5 μl ) ，并将不同梁料的反应放在单独的管。
( 2 ) 每管加入： 5 μl 氨基烯丙基纯化的 cDNA ( 见 3 . 5 节步骤 3 ) ，3 μl 1 mol/L NaHCO3 标记缓冲液，2 μl ALexa 荧光染料 555 或者 647，10 ml 无核酸酶水。
( 3 ) 移液器混匀，室温黑暗孵育 1 h。
( 4 ) 用 mini Elute columns 试剂盒（Qiagen) 去除没有与 aa-dUTP- cDNA 偶联的染料( 见注18)。
3.7 cDNA 芯片杂交
( 1 ) 取 20 μl 混合的标记 cDNA ( 来自 3. 6 节步骤 6 的两个 Alexa 染料）加入到 25 μl 2x 杂交缓冲液和 2 ml poly (dA ) 。
( 2 ) 探针在 95℃ 3 min 变性。
( 3 ) 标记的探针涂在盖片上，并将载片印有 Code Link 面朝下放置。
( 4 ) 将芯片杂交盒置于烘箱内 42℃ 过夜。
( 5 ) 将芯片置于含有溶液 A 的 Falcon 管（蓝帽）中（见 2. 6 节步骤 2 ) ，室温颠倒 15 min (见注 19)。
( 6 ) 将芯片转移到第二个含有溶液 A 的 Falcon 管中，室温颠倒 15 min。
( 7 ) 将芯片转移到第三个含有溶液 B 的 Falcon 管中（ 见 2 . 6 节步骤3 ) ，室温颠倒 15 min。
( 8 ) 将芯片转移到第四个含有溶液 C 的 Falcon 管中（见 2 . 6 节步骤3 ) ，室温颠倒 15 min。
( 9 ) 将芯片放置干燥的 Falcon 管中，立刻 8000 g 离心干燥。
( 10 ) 用 Axon 仪器公司的 Gene-Pix 400B 型双激光扫描仪扫描杂交芯片。
3.8 cDNA 芯片数据分析
芯片做图像分析，检测每一个观测点的两种荧光信号的强度，以此来评估成对小麦系之间转录基因的表达差异。数据标准化后，作适合某个模型的统计分析，说明实验设计 ，检测差异表达的显著性。
3.8.1 图像分析和标准化
芯片上的点用 GenePix 软件扫描成图像（Gene Pix 第 5 版，美国 Axon 仪器公司），然后所有的点进行人工检测，排除杂交失败或者信号弱的。图像分析给出了每一点的所有像素，这些数据包含了两种荧光染料信号（647和 555 ) 的平均值和 Log2 比率值。这些数据专用于差异表达分析。将数据从 GenePix 导入 GeneSpring 软件包 （GeneSpring 6. 2 美国硅遗传公司），然后信号强度的 Log2 比率值进行标准化。本研究中，一个点的 Log2 比率值（差异表达的）（ M ) 和 Log2 乘积（亮度的）（ A ) 之间的比较表明，局部加权光滑描点技术（ LOWESS ) 标准化处理，可用于消除数据不佳的趋势。换句话说,所有点的 Log2 比率值乘以 （ across ) 光 强 （ Log 乘积）应该在一个恒定范围内，但图像显示有一些会随着 A 増加而发生变化的趋势。因此，标准化处理的目的是消除 Log2 比率数据的系统变异（ 比如由于实验过程）。局部加权光滑描点技术（ LOWESS ) 标准化处理，是通过逐点检测 M 和 A 值之间的关系，然后相应地调整 M 值（adjusted M = MLOWESS- fittedM) 。由于有两个独立的实验， L 88-31、 L 88-18和 B 102-1-1的数据与 Cadenza的数据分开处理。
3.8.2 统计分析
参考 Kerr [ 15 ] 讨论的方法，使用 GenStat 统计系统（ GenStat 第 7 版 ，GenStatProcedure Library Release PL15， Lawes Agricultural Trust, Rothamsted Research Harpenden, U K ) 分析规范化的数据（ 进一步的详细信息见[ 5 ] 及其补充材料）。在估计基因的固定效应之前，用符合 Log2 比率的线性混合模型来估算实验设计（ 生物学和技术重复）的随机效应。该模型通过模型计算用数据的整体残差（ 噪声）估计标准误参 数（一个基因一个参数）。每个参数对其标准误的比率服从残留自由度的 t 统计分布，这使得从 0 (Log2 范围）开始的差异表达统计上显著性得到评估。在我们的研究中，通过表达量和拷贝数筛选显著差异表达基因（ P <0.05 )，只有那些表达差异大于 1.5 倍并且存在多 2 次以上重复的基因被保留下来做进一步分析。
3.8.3 用实时 RT-qPCR 验证差异表达
挑选转录本做实时 RT- qPCR 验证芯片表达数据，见 3.13 节。
3.9 芯片数据介绍
对简单的实质等同性实验来说，一个比较转基因系与对照之间基因表达的散点图就已足够了。文献 [ 5 ] 中参与两个实验的样品都标注在图15. 2中。结果用 GeneSpring 软件包显示，绘制了每组比较小麦系之间每个基因成对的平均强度，并突出显示少数感兴趣的基因（统计上显著差异表达）。结果也在表15 . 2 中作了数值化总结。
结果表明，转基因并未影响显著数量的内源性基因的表达，转基因植物实质等同于其相应的非转基因对照或亲本[ 5 ] 。结果也证实了转化方法（ 如干净片段或者整个质粒）对基因表达模式影响不大。实质等同性实验强调统计上的严谨性，对 cDNA 芯片来说 ，考虑诸如染料偏好性和芯片空间变异等的问题（ 见注20，目前 cDNA 芯片实验数据分析的评价）。
对于简单的实质等同性实验而言，一张简单的比较转基因系和对照系之间表达的散点图就可以了，更复杂的设计可能需要其他的显示方式。无论是 cDNA、寡核苷酸芯片或者其他平台，分层聚类是一种有力的转录组数据概览方法 [16]。这种方法将有基因关联表达的样品和（或）基因分组，不同的关联程度以树状图可视化。它通常是以热图样式显示的：基因树在一边，样品树在另一边，颜色代表基因的表达量。如果检测到处理对表达有影响，不同处理的样品会表现为不同的分支，所有重复出现在这些分支内的叶片上；在另一维，不同表达的基因也会聚在一起。
基因表达谱的非分层聚类方法，如 K 均值、质量阈值（QT ) 和自组织映射等也是常用到的。基因簇的平均表达值可以简化转录组数据。共表达意味着共同的转录调控和潜在的功能关系。进一步检查基因簇内基因，以确定是否有任何共同的已知功能（如蛋白质储存、应激反应或防御），或参与共同途径。对于作物如小麦中的绝大多数基因，功能只可能从序列相似性推测。聚类分析，显示和注释工具可以在开放资源 [ 如 Bioconductor (http://www .bioconductor .org / ) ] 和商业软件包 [ 如 GeneSpring (AgilentTechnologies, Inc) ] 获得。
3.10 分析小麦基因芯片背景
这里概述了 Affymetrix 基因芯片表达分析应遵循的步骤。详细的标准流程可以在“ Affymetrix 基因表达分析技术手册”中查询（见注 21 ) 。
基因芯片探针芯片是由 Affymetrix 公司制造的（见注 22) 。现在许多大学和私入公司已全面配备 Affymetrix Gene Chip TM 芯片平台，为客户提供各种芯片检测过程服务（GeneChip芯片探针购买、cDNA 标记、芯片杂交、扫描、芯片分析等）。
Affymetrix Wheat Gene Chip 芯片由 AffymetrixGene Chip Consortia Program 制造，包含了 61127 套探针，代表小麦基因组所有 42 条染色体上 55052 个转录本。芯片是基于 GenBank 和 dbEST ( http://www.affymetrix.com/community/research/consortia .affx ) 上发表的功能域数据设计的。小麦基因组芯片可用于不同小麦种的基因表达研究： UniGene Build 38，2004 . 4 . 24 ) 。该芯片包含了至 2004 年 5 月，所有这些种的 EST 和全长序列设计的探针。
GeneChip 探针芯片制造过程结合了光刻和化学合成技术。1.7cm2 的芯片上有几万到几十万个不同的寡核苷酸探针，每个探针点（探针室）20 mm。每一个目标转录组由一套长度 25 个碱基的 11 个 PM 和 11 个 MM 探针来检测。这些 PM 和 MM 探针（探针对）位置彼此相邻。基因表达水平可以用 Affymetrix 软件通过 PM 和 MM 探针之间亮度差异来计算（见注22) ，或者只用 PM 探针的亮度计算（RMA 和 gcRMA 分析）。
3.11 小麦基因芯片表达分析
3.11.1 RNA 样品准备
对于特定组织，RNA [ 总 RNA 或者提纯的 poly ( RNA species ) ] 提取和纯化可以采用已有的步骤（步骤与 3. 4节叙述的类似）。RNA 提取也有许多商业试剂盒可供选择。例如，TRIZOL - Reagent (Invitrogen ，见注2 3 ) 被推荐为小麦旗叶的总 RNA 提取方法。当提取物含有大量的糖蛋白和多糖时，标准步骤中匀浆（TRIZOLRNA提取说明步骤1 ) 和 RNA 沉淀（TRIZOLRNA 提取说明步骤 3 ) 需要略作修改。匀浆这一步，匀浆产物需要增加一步离心（见注 24) 。RNA 沉淀这一步，水相回收沉淀总 RNA 需要用异丙醇和高盐沉淀溶液（见注 25) 。为了得到高纯度 RNA ( 特别是 A260/A230。比值 >1.8)，我们还建议 RNA 过 RNeasy 柱（Qiagen，见注26 ) 洗涤。RNA 清理建议放在总 RNA 样品中去除基因组 DNA 之后进行（见 3.4 节）。核酸浓度和质量分别用 Nanodrop ND 1000 分光光度计和 Aglient 2100 生物分析仪（RNA 6000 Nano Assay, Agilent Technologies , Palo，Alto，CA , USA ) 检测（见注 16)。
3.11.2 cDNA 合成和标记（见注 27 )
从总 RNA [ 或者纯化的 poly ( A ) RNA ] 合成双链 cDNA，然后生物素标记的 cRNA 由 cDNA 体外转录。与基因探针芯片杂交前，发现 cRNA 片段对于最高灵敏度是很关键的。
3.11.3 杂交（见注 28)
准备杂交混合物包括 cRNA 片段和探针芯片对照。与探针芯片杂交，孵育 16 h。
3.11.4 探针芯片洗脱与染色
( 1 ) 流体工作站（fluidic station ) 的设置： 流体工作站是用于芯片洗脱和染色的。它是通过兼容 PC 工作站上 GeneChip Operating System ( GCOS ) /Microarray Suite 操作的。步骤包括设置和启动流体工作站（见注 29 和注 30)。
( 2 ) 芯片的洗涤和染色（见注 31 ) : 16 h 杂交后，除去芯片上杂交液（ 见注 28) ，然后将芯片完全浸入适当体积推荐的清洗液（见注 31)。
3.11.5 芯片扫描（见注 31)
一旦扫描结束，每张完整的芯片图保存在一个以.dat 为扩展名、实验名字命名的文件。GCOS 采集和分析芯片图谱及实验数据：定义探针单元并计算每个单元的光强度 ( 见注 22) 。由于制造过程中的更高的质量控制，许多 cDNA 芯片图谱分析的问题，如空间变异对 Affymerix 芯片来说不用考虑（ 3.8 节）。产生了包含每一个 PM 和 MM 探针信号值的输出文件（cel 文件）。
3.12 小麦基因芯片数据分析
Affymetrix 公司芯片广泛用于许多种生物，人们投入了相当大的精力来开发和测试不同的方法分析信号，以寻找最好的基因表达检测方法。Affymetrix 开发的方法是以一组探针的 PM 和 MM 之间的平均差异来估计表达（ MAS5 ) 。然而，MM 信号值的有效性还有疑问，而且有一些替代的方法看起来事实上超过了 MAS5。RMA (robustmultichipaverage) 算法取一个实验的所有 PM 数据（如全部 cel 文件），不仅标准化每个芯片表达数据中位数，而且对每个芯片表达数据使用相同的方差 [17]。gcRNA 算法是 RMA 一个变种，它将每个探针的 GC 组成对信号贡献的权重考虑在内[18]。与其他方法相比，在标样 [ 19 ] 检测和实时反转录 PCR 定量 [ 20 ] 方面，它能很好处理 Affymetrix 芯片数据。gcRNA 算法可以使用开源的 Bioconductor 软件包（http :// w w w .bioconductor .org) 或者商业软件如 GeneSpring7 (Agilent Technologies, Inc) 。
一旦选择了表达检测方法（如 MAS5、RMA 、gcRNA 或者其他），接下来的分析是一样的，而非标准化数据（ 如 MAS5 ) 必须首先进行标准化（如除以每一个芯片表达值的中位数）。建议先筛选探针集，保留绝对表达值高于阈值（至少一个样品如此）的所有探针（可以从芯片中非小麦对照的信号判断）。这些探针进一步筛选那些表达差异在任何一对样品的阈值之上的；通常 1.4 倍的变化被认为是可以检测到的最小值。实质等同性实验设计通常有 2 个以上基因型，至少 3 次生物学重复。为了检测到基因型之间统计上显著差异表达的基因，对每个探针集的表达值的对数（它们通常呈对数正态分布）作方差分析 （ANOVA ) 。假定即使经过筛选，探针数量依然非常大，可以用多重检验校正。Benjamini-Hochberg 假阳性率（ FDR ) 校正 [ 21 ] 是不错的选择。对许多探针做经典的 P＜0.05 的方差分析和 Benjamini-Hochberg 多重检验校正，能够有大约 5% 的基因通过纯属偶然。然而，如果很少或根本没有基因通过此校正，可以取消多重检测，方差结果是假阳性率所致。例如，如果 1000 个探针 P <0.05 测验，50 通过了但没有多重检验校正，这只是不超过预计的运气。重要基因名单的实质等同性标准是与 cDNA 芯片实验相同的 [ 5 ] 。
3.13 实时 RT- PCR 验证转录组数据
有两种常用的基因（扩增子）定量检测方法：基因特异荧光探针（如 TaqMan chemistry) 或者特异双链 DNA 结合试剂（SYBR green chemistry ) [22]。我们通过实时 RT-PCR，选择 SYBR green chemistry 来验证 cDNA 芯片发现的 DEG 的表达。不同的基因设计特异引物（见注 32) 。
3.13.1 实时 RT- PCR 反应的准备
( 1 ) PCR 用可视化的 96 孔板在 ABIPRISMA 7500 Sequence Detection System 仪器上进行 ( Applied Biosystems， Foster City， CA，USA ) 。
( 2 ) 总 RNA ( 2 μg 脱氧核糖核酸酶处理过的 RNA，来自 3.4 节）用反转录酶和缓冲液（Superscript EIRT， Invitrogen ) 按照说明手册反转录。
（3 ) PCR 反应用 25 μl 体系：100 ng cDNA，12.5 μl 2X 带 SYBR 绿色荧光染料的 Platinum qPCR Super Mix-UDG ( Invitrogen ) ，0.5 μl ROX 参照染料（Invitrogen ) ，一对特异引物（每个引物 200 ng) ( 见注 33 ) 。
( 4 ) 所有 PCR 反应用了如下标准温度控制：50℃ 2 min , 95°C 2 min , 40 个循环：95℃ 15s 和 60°C 1 min ( 见注 34)。
3.13.2 实时 PCR 数据提取和分析
( 1 ) 原始数据提取。收集每个样品循环阈值（Ct ) [23]。为了比较不同的 cDNA 样本的 Ct 值，所有比较基因的 Ct 值都根据看家基因 actin 进行标准化 （见注释 35) 。
( 2 ) 数据分析。使用 Pfaffl 推荐的方程式计算选择基因的相对表达量 [24] 。这些算法包括校正基因扩展效率。不同目标基因和参照基因的 PCR 扩增效率估计使用 Ramakers 等 [ 25 ] 推荐的方程式。
3.14 递交芯片数据到公共数据库：ArrayExpress
芯片的数据应存放在公共数据库：ArrayExpress [ 26 ] 是在欧洲生物信息研究所( EBI) 的高通量功能基因数据的公共数据库 。这个数据库由两部分组成：ArrayExpress 库（MIAME，主要是初级归档）和 ArrayExpress 数据 库（它是不断注释的选择基因表达谱数据库）。ArrayExpress 是 MGED ( 基因芯片表达数据协会）推荐的三个公共芯片数据库之一。它以保密的形式存储文章使用的数据，允许获得授权的用户，如期刊编辑和审稿入登录数据，文章发表后与其相关的数据可以在指定日期公开。一般情况下，芯片数据提交包括 4 个主要步骤：① 创建一个提交用的新账户（MX 账户）；② 提交程序（芯片制备方案、样品的生长和提取步骤、样品标记、杂交，扫描、分析步骤等）；③ 提交芯片设计（ 名称、设计、技术等） ； ④ 提交实验 （ 实验设计、发表的论文、样品、提取物等）。有关的详细信息请参阅网页： http ://www . ebi. ac. uk/ miamexpress/ Help。
3.15 统计模型
剩余最大似然法（REML 法） [ 27 ] 在 GenStat 第 7 版 （ 2003年）统计系统中应用 ，适合于混合模型（ 包括随机和固定效应），以从任何特定比较（ 如 14dpa 的 B102-1-1与 L88-31 ) 中，每个基因多达 6 个观察值，建立一套完整的数据集。根据模型偏差估算实验设计中由生物学重复和技术重复所组成的方差，不同的模型之间进行测试时，随自由度变化的其方差变化服从 x2 分布。使用 Wald 检验 [ 28 ] 评估模型中的固定效应，测试统计量也服从 x2 分布。因此，建模考虑了设计上的变异效应（ 随机效应）和固定效应 （ 9246 个基因）。经过随机和固定参数（term) 的显著性评估，在 14dpa 的 B 102-1-1 和 L 88-31 比较模型是：
我们使用了 19846 个点，包含 9246 个 Unigene 序列的小麦 cDNA 芯片（http://www . cerealsdb. uk. net/index. htm) 用于详细的转录组研究 [3 ] 。重复的 unigene 集合阵列点到了 Codelink 活化芯片上（Amersham Biosciences Ltd, UK ) 。
芯片杂交用与 aa- dUTP- cDNA 样品荧光标记染料反向的染料——Alexa 荧光染料 555 和 647。杂交在转基因系 （B 102-1- 1、B1118-8-4 或 B1355-4-2 ) 和其原始非转基因系 ( L 88-31 或 Cadenza ) 之间的两个胚乳发育阶段（开花后 14 天和 28 天，dpa ) 和叶片 ( 发芽后 8 天，dpg ) 成对比较 [5]。每个材料取样 3 次，检测 2 次。
cDNA 芯片的优势是经济实惠，并允许使用者完全控制内容和设计（定制芯片）。相反，Affymetrix 寡核苷酸芯片更加灵活，它是单染料系统，使试验更简单、更特异(提高对类似的异构体和多基因家族成员的识别能力），提供更量化和易比较的数据。GeneCMp 基因组芯片，采用了一套能匹配任何转录序列的 25 碱基寡核苷酸“探针”。以小麦芯片为例，每组探针有 11 个，多数与组装的序列表达标签（ EST ) 的公共保守域序列一致。因此，在 cDNA 芯片中，每一组探针对应的是许多 EST，而不是单个的 EST。为了识别不同的转录本，同时满足其他条件，如 GC 含量相对一致，探针通过程序自动化设计。对于一个目标转录本，设计了 一个完全匹配的探针（perfect matches，PM ) 、一个单碱基错配探针（mismatches，MM ) ，这样能对非特异杂交有一个估计和矫正。然而，对于 MM 探针的真正信号值存在争论，许多广泛使用的分析方法不用 MM 探针（ 见 3.10节）。短 探针（ 如 25-mer) 对于序列相似的转录本更有效，因为单个碱基错配足够使杂交不稳定，而且固定长度使得杂交条件可以标准化，以满足所有探针；相反，较长的可变长度的探针，比如那些 cDNA 芯片平台使用的探针，将不可避免与任何与其部分序列相似性探针杂交，所以其真实信号集成了几个不同的转录分子。
3.2 植物材料和生长条件
转录组比较研究使用了三个六倍体转基因面包小麦的胚乳和叶片。转基因小麦品系 B102 -1-1 ( L 88-31 背景） [ 6, 7 ] 和 B1118-8-4 ( Cadenz 北背景）[ 5 ] 由基因枪共转化两个质粒产生[ 14 ] 。一个质粒是 p1Axl 质粒 [ 13 ] ，含有由自身的胚乳特异启动子驱动的高分子质量谷蛋白亚基 1AX1 ( Glu-M ) 基因； 另一个质粒含有选择基因bar 和标记基因 uidA，由玉米泛素启动子驱动。转基因系 B1355-4-2 [ 5 ] 也来自 Cadenza，共转化获得只含 IAX1 基因和 bar 基因编码序列的“干净”片段。一个常规育种系 L88-18 [ 9 ] 是 L88- 31 的姐妹系，也用于转录组比较。两个常规育种系 ( L 88-31、L 88-18 ) 和转基因系（B 102-1-1 ) 的转录组两两比较是：B 102-1-1与 L 88-31、L 88-18与 L 88-31、 B 102-1-1与 L 88-18。转化方法的比较，即 “干净”片段与整个质粒的比较：B1355-4-2 与 Cadenza、 B1118-8-4 与 Cadenza、 B1355-4-2 与 B1118-8-4。本研究所用的不同面包小麦携带的相关基因成分的详细信息见表15 . 1 。
( 1 ) 植物种在平衡行列设计的盆钵中，每个处理（小麦生长发育阶段）有 3 个生物学重复。
( 2 ) 开花后 14 天和 28 天胚乳，取样的植物每盆种 2 株。每一株只保留 2 个分蘖。选中的盆钵（本试验为 3 个生物学重复）包括用于发芽后第 8 天取叶片的第三株植物。
( 3 ) 每天观察穗，一旦发现中央小穗开花就做标记。
( 4 ) 在无菌条件下，手工从颖果剥离种子胚乳；每盆只从 2 个穗子的中部分别取至少 24 枚胚乳为一个样品。
( 5 ) 样品都是一天中同一时间取样，以避免昼夜节律的影响。
3.3 SDS-PAGE
通过谷粒总蛋白 SDS-PAGE 凝胶电泳，检测所有小麦系的高分子质量亚基蛋白的表达（图 15. 1 ) ，使用 10% ( m/V) 丙烯酰胺凝胶和 Tris-硼酸缓冲液系统 [ 10 ] 。
3.4 RNA 提取
3.4.1 小麦胚乳总 RNA 提取
提取方法根据 Chang 等 [ 11 ] 改编而来。
( 1 ) 用预冷的研钵和杵（-70°C ) 在液氮里将 2~3 g 组织磨成粉末（见注 8 ) 。
( 2 ) 室温下迅速将磨碎组织转移到有 15 ml 提取缓冲液（加入 300 μl β-巯基乙醇 ) 的离心管中，充分颠倒混匀（ 见注9) 。
( 3 ) 用等体积氯仿：异戊醇（终体积 15 ml ) 抽提两次，液相分离用 15000 g 室温离心 10 min。
( 4 ) 上清液加 0.25 倍体积 10 moI/L LiCl 混匀。4℃ 过夜沉淀 RNA，4℃、15000 g，离心 20 min 获取 RNA。
( 5 ) 500 ml SSTE 悬浮沉淀颗粒。
( 6 ) 用等体积氯仿：异戊醇抽提一次。
( 7 ) 上清液加两倍体积乙醇，-70℃ 沉淀 30 min 以上或者 -20℃ 沉淀 2 h。
( 8 ) 15000 g 离心 20 min 沉淀 RNA。
( 9 ) 75% 乙醇洗涤。
( 10 ) 干燥沉淀并溶解于无核酸降解酶水中。
3.4.2 发芽后 8 天幼苗 RNA 提取
提取方法根据 Cheng 等 [ 12 ] 改编而来。
( 1 ) 用预冷的研钵和杵（-70℃ ) 加液氮里将已知质量组织（大约 1 g 幼叶）磨成粉末（见注9) 。
( 2 ) 将冷冻的粉末快速转移到第二个有 10~15 ml 匀浆缓冲液的研钵中（见注10)，继续研磨至均匀（见注 11)。
( 3 ) 匀浆液转移到 50 ml 带帽的圆底旋盖离心管中，60℃ 孵育 10 min ( 匀浆液终体积 5~10 ml )。
( 4 ) 离心管置冰上冷却，加 0.2 倍体积 pH 5.5 的 5 mol/L 乙酸钾（见注 12) ，轻轻地充分混匀，然后冰上静置 10~15 min。
( 5 ) 10000 g、4℃ 离心 15 min , 取上清液到新的离心管中。
( 6 ) 加等体积酚：氯仿（1 : 1，V/V ) 混匀，拧紧瓶盖并剧烈振荡 10 min。10000 g、21°C 离心 10 min。取上层水相于新离心管中（见注13)。
( 7 ) 水相重复上一步的酚：氯仿萃取和分层。
( 8 ) 往水相加 0~1 倍体积 3 mol/L pH 5.3 乙酸钠和 2.5 倍体积乙醇。混匀后 -20℃ 孵育过夜以提高核酸沉淀效率。
( 9 ) 10000 g 、4℃ 离心 30 min 沉淀核酸，弃上清。倒置离心管数分钟。
( 10 ) 少量无核酸降解酶水（ 300~700 μl ) 溶解沉淀。核酸溶液转移到 Eppendorf 管，加 0.67 倍体积 10 mol/L 氯化锂沉淀 RNA。拌匀，冰上孵育 20~30 min ( 见注14)。
( 11 ) 离心（15000 g，室温，20 min ) 沉淀 RNA，弃上清。
( 12 ) 用尽可能小体积（ 200~300 μl) 的无核酸酶水溶解沉淀，重复氯化锂沉淀，和上一步同样离心沉淀 RNA。
(13 ) 200 μl 无核酸酶水溶解沉淀，加入 15 μl 5 mol/L 乙酸钾（pH 5.5 ) 和 800 μl 乙醇。混匀，离心（15000 g 室温，20 min) 沉淀 RNA ( 见注15)。
( 14 ) 弃上清，加入 1.0 ml 80% ( V/V ) 乙醇，离心洗涤 RNA ( 15000 g，室温，10 min)。
( 15 ) 离心管开盖置于超净工作台，室温干燥沉淀不超过 10 min。溶解于 100~200 μl 无核酸酶水中。将每份样品分成等量小份以避免在反复冻融过程中污染或者降解。
3.4.3 总 RNA 样品除去基因组 DNA
RNA 提取之后用 DNA-free ( DNA 酶处理和清除试剂盒，Ambion) 按照使用说明处理 RNA 片段。该系统专为去除 RNA 样品中的 DNA 杂质和清除处理后的 DNA 降解酶 I，无需加热或苯酚提取。
3.4.4 RNA 定量分析和质量控制
RNA 浓度、完整性及质量检测使用 Nanodrop ND 1000 分光光度计（Labtech Int ,U K ) 和 Agilent 2100 生物分析仪 ( RNA 6000 Nano Assay, Agilent Technologies, PaloAlto, CA，USA ) ( 见注 16)。
3.4.5 样品保存
RNA 样品短期（最长 3 个月）保存在 -20℃，长期则在 -80℃。
3.5 cDNA 合成
( 1 ) 加 100 μg DNA 酶处理过的总 RNA ( 不超过 20 μl) 、8 μl oligo (dT)23 锚定引物和无核酸酶水至终体积 28 μl。
( 2 ) 将启动反应混合物在 70℃ 孵育 10 min，置于冰上 5 min。
( 3 ) 向启动反应混合物加入 cDNA 合成反应混合物：10 μl 5x 第一链缓冲液，10 μl 0.1 mol/L DTT，5 μl 50x aa-dNTP 混合物，2 μl Superscript 逆转录酶Ⅲ（ 200 U/L ) ，加无核酸酶水至终体积 50 μl。
( 4 ) 42℃ 孵育 2~3 h。
( 5 ) 用微型离心柱（Qiagen) 参照使用说明纯化 aa-dUTP-dDNA 产物。
( 6 ) 收集最后的洗脱液 10 μl 作为样品。cDNA 的产品将用于准备芯片杂交的探针和实时 RT- PCR 技术。最后反应可不用 50x aa-dNTP 混合物进行（见注 17)。
3.6 cDNA 芯片标记
( 1 ) 为了 cDNA 与突光染料偶联反应，将需要反向染料标记的总 cDNA ( 见第3.5节步骤6 ) 分成两等份（5 μl ) ，并将不同梁料的反应放在单独的管。
( 2 ) 每管加入： 5 μl 氨基烯丙基纯化的 cDNA ( 见 3 . 5 节步骤 3 ) ，3 μl 1 mol/L NaHCO3 标记缓冲液，2 μl ALexa 荧光染料 555 或者 647，10 ml 无核酸酶水。
( 3 ) 移液器混匀，室温黑暗孵育 1 h。
( 4 ) 用 mini Elute columns 试剂盒（Qiagen) 去除没有与 aa-dUTP- cDNA 偶联的染料( 见注18)。
3.7 cDNA 芯片杂交
( 1 ) 取 20 μl 混合的标记 cDNA ( 来自 3. 6 节步骤 6 的两个 Alexa 染料）加入到 25 μl 2x 杂交缓冲液和 2 ml poly (dA ) 。
( 2 ) 探针在 95℃ 3 min 变性。
( 3 ) 标记的探针涂在盖片上，并将载片印有 Code Link 面朝下放置。
( 4 ) 将芯片杂交盒置于烘箱内 42℃ 过夜。
( 5 ) 将芯片置于含有溶液 A 的 Falcon 管（蓝帽）中（见 2. 6 节步骤 2 ) ，室温颠倒 15 min (见注 19)。
( 6 ) 将芯片转移到第二个含有溶液 A 的 Falcon 管中，室温颠倒 15 min。
( 7 ) 将芯片转移到第三个含有溶液 B 的 Falcon 管中（ 见 2 . 6 节步骤3 ) ，室温颠倒 15 min。
( 8 ) 将芯片转移到第四个含有溶液 C 的 Falcon 管中（见 2 . 6 节步骤3 ) ，室温颠倒 15 min。
( 9 ) 将芯片放置干燥的 Falcon 管中，立刻 8000 g 离心干燥。
( 10 ) 用 Axon 仪器公司的 Gene-Pix 400B 型双激光扫描仪扫描杂交芯片。
3.8 cDNA 芯片数据分析
芯片做图像分析，检测每一个观测点的两种荧光信号的强度，以此来评估成对小麦系之间转录基因的表达差异。数据标准化后，作适合某个模型的统计分析，说明实验设计 ，检测差异表达的显著性。
3.8.1 图像分析和标准化
芯片上的点用 GenePix 软件扫描成图像（Gene Pix 第 5 版，美国 Axon 仪器公司），然后所有的点进行人工检测，排除杂交失败或者信号弱的。图像分析给出了每一点的所有像素，这些数据包含了两种荧光染料信号（647和 555 ) 的平均值和 Log2 比率值。这些数据专用于差异表达分析。将数据从 GenePix 导入 GeneSpring 软件包 （GeneSpring 6. 2 美国硅遗传公司），然后信号强度的 Log2 比率值进行标准化。本研究中，一个点的 Log2 比率值（差异表达的）（ M ) 和 Log2 乘积（亮度的）（ A ) 之间的比较表明，局部加权光滑描点技术（ LOWESS ) 标准化处理，可用于消除数据不佳的趋势。换句话说,所有点的 Log2 比率值乘以 （ across ) 光 强 （ Log 乘积）应该在一个恒定范围内，但图像显示有一些会随着 A 増加而发生变化的趋势。因此，标准化处理的目的是消除 Log2 比率数据的系统变异（ 比如由于实验过程）。局部加权光滑描点技术（ LOWESS ) 标准化处理，是通过逐点检测 M 和 A 值之间的关系，然后相应地调整 M 值（adjusted M = MLOWESS- fittedM) 。由于有两个独立的实验， L 88-31、 L 88-18和 B 102-1-1的数据与 Cadenza的数据分开处理。
3.8.2 统计分析
参考 Kerr [ 15 ] 讨论的方法，使用 GenStat 统计系统（ GenStat 第 7 版 ，GenStatProcedure Library Release PL15， Lawes Agricultural Trust, Rothamsted Research Harpenden, U K ) 分析规范化的数据（ 进一步的详细信息见[ 5 ] 及其补充材料）。在估计基因的固定效应之前，用符合 Log2 比率的线性混合模型来估算实验设计（ 生物学和技术重复）的随机效应。该模型通过模型计算用数据的整体残差（ 噪声）估计标准误参 数（一个基因一个参数）。每个参数对其标准误的比率服从残留自由度的 t 统计分布，这使得从 0 (Log2 范围）开始的差异表达统计上显著性得到评估。在我们的研究中，通过表达量和拷贝数筛选显著差异表达基因（ P <0.05 )，只有那些表达差异大于 1.5 倍并且存在多 2 次以上重复的基因被保留下来做进一步分析。
3.8.3 用实时 RT-qPCR 验证差异表达
挑选转录本做实时 RT- qPCR 验证芯片表达数据，见 3.13 节。
3.9 芯片数据介绍
对简单的实质等同性实验来说，一个比较转基因系与对照之间基因表达的散点图就已足够了。文献 [ 5 ] 中参与两个实验的样品都标注在图15. 2中。结果用 GeneSpring 软件包显示，绘制了每组比较小麦系之间每个基因成对的平均强度，并突出显示少数感兴趣的基因（统计上显著差异表达）。结果也在表15 . 2 中作了数值化总结。
结果表明，转基因并未影响显著数量的内源性基因的表达，转基因植物实质等同于其相应的非转基因对照或亲本[ 5 ] 。结果也证实了转化方法（ 如干净片段或者整个质粒）对基因表达模式影响不大。实质等同性实验强调统计上的严谨性，对 cDNA 芯片来说 ，考虑诸如染料偏好性和芯片空间变异等的问题（ 见注20，目前 cDNA 芯片实验数据分析的评价）。
对于简单的实质等同性实验而言，一张简单的比较转基因系和对照系之间表达的散点图就可以了，更复杂的设计可能需要其他的显示方式。无论是 cDNA、寡核苷酸芯片或者其他平台，分层聚类是一种有力的转录组数据概览方法 [16]。这种方法将有基因关联表达的样品和（或）基因分组，不同的关联程度以树状图可视化。它通常是以热图样式显示的：基因树在一边，样品树在另一边，颜色代表基因的表达量。如果检测到处理对表达有影响，不同处理的样品会表现为不同的分支，所有重复出现在这些分支内的叶片上；在另一维，不同表达的基因也会聚在一起。
基因表达谱的非分层聚类方法，如 K 均值、质量阈值（QT ) 和自组织映射等也是常用到的。基因簇的平均表达值可以简化转录组数据。共表达意味着共同的转录调控和潜在的功能关系。进一步检查基因簇内基因，以确定是否有任何共同的已知功能（如蛋白质储存、应激反应或防御），或参与共同途径。对于作物如小麦中的绝大多数基因，功能只可能从序列相似性推测。聚类分析，显示和注释工具可以在开放资源 [ 如 Bioconductor (http://www .bioconductor .org / ) ] 和商业软件包 [ 如 GeneSpring (AgilentTechnologies, Inc) ] 获得。
3.10 分析小麦基因芯片背景
这里概述了 Affymetrix 基因芯片表达分析应遵循的步骤。详细的标准流程可以在“ Affymetrix 基因表达分析技术手册”中查询（见注 21 ) 。
基因芯片探针芯片是由 Affymetrix 公司制造的（见注 22) 。现在许多大学和私入公司已全面配备 Affymetrix Gene Chip TM 芯片平台，为客户提供各种芯片检测过程服务（GeneChip芯片探针购买、cDNA 标记、芯片杂交、扫描、芯片分析等）。
Affymetrix Wheat Gene Chip 芯片由 AffymetrixGene Chip Consortia Program 制造，包含了 61127 套探针，代表小麦基因组所有 42 条染色体上 55052 个转录本。芯片是基于 GenBank 和 dbEST ( http://www.affymetrix.com/community/research/consortia .affx ) 上发表的功能域数据设计的。小麦基因组芯片可用于不同小麦种的基因表达研究： UniGene Build 38，2004 . 4 . 24 ) 。该芯片包含了至 2004 年 5 月，所有这些种的 EST 和全长序列设计的探针。
GeneChip 探针芯片制造过程结合了光刻和化学合成技术。1.7cm2 的芯片上有几万到几十万个不同的寡核苷酸探针，每个探针点（探针室）20 mm。每一个目标转录组由一套长度 25 个碱基的 11 个 PM 和 11 个 MM 探针来检测。这些 PM 和 MM 探针（探针对）位置彼此相邻。基因表达水平可以用 Affymetrix 软件通过 PM 和 MM 探针之间亮度差异来计算（见注22) ，或者只用 PM 探针的亮度计算（RMA 和 gcRMA 分析）。
3.11 小麦基因芯片表达分析
3.11.1 RNA 样品准备
对于特定组织，RNA [ 总 RNA 或者提纯的 poly ( RNA species ) ] 提取和纯化可以采用已有的步骤（步骤与 3. 4节叙述的类似）。RNA 提取也有许多商业试剂盒可供选择。例如，TRIZOL - Reagent (Invitrogen ，见注2 3 ) 被推荐为小麦旗叶的总 RNA 提取方法。当提取物含有大量的糖蛋白和多糖时，标准步骤中匀浆（TRIZOLRNA提取说明步骤1 ) 和 RNA 沉淀（TRIZOLRNA 提取说明步骤 3 ) 需要略作修改。匀浆这一步，匀浆产物需要增加一步离心（见注 24) 。RNA 沉淀这一步，水相回收沉淀总 RNA 需要用异丙醇和高盐沉淀溶液（见注 25) 。为了得到高纯度 RNA ( 特别是 A260/A230。比值 >1.8)，我们还建议 RNA 过 RNeasy 柱（Qiagen，见注26 ) 洗涤。RNA 清理建议放在总 RNA 样品中去除基因组 DNA 之后进行（见 3.4 节）。核酸浓度和质量分别用 Nanodrop ND 1000 分光光度计和 Aglient 2100 生物分析仪（RNA 6000 Nano Assay, Agilent Technologies , Palo，Alto，CA , USA ) 检测（见注 16)。
3.11.2 cDNA 合成和标记（见注 27 )
从总 RNA [ 或者纯化的 poly ( A ) RNA ] 合成双链 cDNA，然后生物素标记的 cRNA 由 cDNA 体外转录。与基因探针芯片杂交前，发现 cRNA 片段对于最高灵敏度是很关键的。
3.11.3 杂交（见注 28)
准备杂交混合物包括 cRNA 片段和探针芯片对照。与探针芯片杂交，孵育 16 h。
3.11.4 探针芯片洗脱与染色
( 1 ) 流体工作站（fluidic station ) 的设置： 流体工作站是用于芯片洗脱和染色的。它是通过兼容 PC 工作站上 GeneChip Operating System ( GCOS ) /Microarray Suite 操作的。步骤包括设置和启动流体工作站（见注 29 和注 30)。
( 2 ) 芯片的洗涤和染色（见注 31 ) : 16 h 杂交后，除去芯片上杂交液（ 见注 28) ，然后将芯片完全浸入适当体积推荐的清洗液（见注 31)。
3.11.5 芯片扫描（见注 31)
一旦扫描结束，每张完整的芯片图保存在一个以.dat 为扩展名、实验名字命名的文件。GCOS 采集和分析芯片图谱及实验数据：定义探针单元并计算每个单元的光强度 ( 见注 22) 。由于制造过程中的更高的质量控制，许多 cDNA 芯片图谱分析的问题，如空间变异对 Affymerix 芯片来说不用考虑（ 3.8 节）。产生了包含每一个 PM 和 MM 探针信号值的输出文件（cel 文件）。
3.12 小麦基因芯片数据分析
Affymetrix 公司芯片广泛用于许多种生物，人们投入了相当大的精力来开发和测试不同的方法分析信号，以寻找最好的基因表达检测方法。Affymetrix 开发的方法是以一组探针的 PM 和 MM 之间的平均差异来估计表达（ MAS5 ) 。然而，MM 信号值的有效性还有疑问，而且有一些替代的方法看起来事实上超过了 MAS5。RMA (robustmultichipaverage) 算法取一个实验的所有 PM 数据（如全部 cel 文件），不仅标准化每个芯片表达数据中位数，而且对每个芯片表达数据使用相同的方差 [17]。gcRNA 算法是 RMA 一个变种，它将每个探针的 GC 组成对信号贡献的权重考虑在内[18]。与其他方法相比，在标样 [ 19 ] 检测和实时反转录 PCR 定量 [ 20 ] 方面，它能很好处理 Affymetrix 芯片数据。gcRNA 算法可以使用开源的 Bioconductor 软件包（http :// w w w .bioconductor .org) 或者商业软件如 GeneSpring7 (Agilent Technologies, Inc) 。
一旦选择了表达检测方法（如 MAS5、RMA 、gcRNA 或者其他），接下来的分析是一样的，而非标准化数据（ 如 MAS5 ) 必须首先进行标准化（如除以每一个芯片表达值的中位数）。建议先筛选探针集，保留绝对表达值高于阈值（至少一个样品如此）的所有探针（可以从芯片中非小麦对照的信号判断）。这些探针进一步筛选那些表达差异在任何一对样品的阈值之上的；通常 1.4 倍的变化被认为是可以检测到的最小值。实质等同性实验设计通常有 2 个以上基因型，至少 3 次生物学重复。为了检测到基因型之间统计上显著差异表达的基因，对每个探针集的表达值的对数（它们通常呈对数正态分布）作方差分析 （ANOVA ) 。假定即使经过筛选，探针数量依然非常大，可以用多重检验校正。Benjamini-Hochberg 假阳性率（ FDR ) 校正 [ 21 ] 是不错的选择。对许多探针做经典的 P＜0.05 的方差分析和 Benjamini-Hochberg 多重检验校正，能够有大约 5% 的基因通过纯属偶然。然而，如果很少或根本没有基因通过此校正，可以取消多重检测，方差结果是假阳性率所致。例如，如果 1000 个探针 P <0.05 测验，50 通过了但没有多重检验校正，这只是不超过预计的运气。重要基因名单的实质等同性标准是与 cDNA 芯片实验相同的 [ 5 ] 。
3.13 实时 RT- PCR 验证转录组数据
有两种常用的基因（扩增子）定量检测方法：基因特异荧光探针（如 TaqMan chemistry) 或者特异双链 DNA 结合试剂（SYBR green chemistry ) [22]。我们通过实时 RT-PCR，选择 SYBR green chemistry 来验证 cDNA 芯片发现的 DEG 的表达。不同的基因设计特异引物（见注 32) 。
3.13.1 实时 RT- PCR 反应的准备
( 1 ) PCR 用可视化的 96 孔板在 ABIPRISMA 7500 Sequence Detection System 仪器上进行 ( Applied Biosystems， Foster City， CA，USA ) 。
( 2 ) 总 RNA ( 2 μg 脱氧核糖核酸酶处理过的 RNA，来自 3.4 节）用反转录酶和缓冲液（Superscript EIRT， Invitrogen ) 按照说明手册反转录。
（3 ) PCR 反应用 25 μl 体系：100 ng cDNA，12.5 μl 2X 带 SYBR 绿色荧光染料的 Platinum qPCR Super Mix-UDG ( Invitrogen ) ，0.5 μl ROX 参照染料（Invitrogen ) ，一对特异引物（每个引物 200 ng) ( 见注 33 ) 。
( 4 ) 所有 PCR 反应用了如下标准温度控制：50℃ 2 min , 95°C 2 min , 40 个循环：95℃ 15s 和 60°C 1 min ( 见注 34)。
3.13.2 实时 PCR 数据提取和分析
( 1 ) 原始数据提取。收集每个样品循环阈值（Ct ) [23]。为了比较不同的 cDNA 样本的 Ct 值，所有比较基因的 Ct 值都根据看家基因 actin 进行标准化 （见注释 35) 。
( 2 ) 数据分析。使用 Pfaffl 推荐的方程式计算选择基因的相对表达量 [24] 。这些算法包括校正基因扩展效率。不同目标基因和参照基因的 PCR 扩增效率估计使用 Ramakers 等 [ 25 ] 推荐的方程式。
3.14 递交芯片数据到公共数据库：ArrayExpress
芯片的数据应存放在公共数据库：ArrayExpress [ 26 ] 是在欧洲生物信息研究所( EBI) 的高通量功能基因数据的公共数据库 。这个数据库由两部分组成：ArrayExpress 库（MIAME，主要是初级归档）和 ArrayExpress 数据 库（它是不断注释的选择基因表达谱数据库）。ArrayExpress 是 MGED ( 基因芯片表达数据协会）推荐的三个公共芯片数据库之一。它以保密的形式存储文章使用的数据，允许获得授权的用户，如期刊编辑和审稿入登录数据，文章发表后与其相关的数据可以在指定日期公开。一般情况下，芯片数据提交包括 4 个主要步骤：① 创建一个提交用的新账户（MX 账户）；② 提交程序（芯片制备方案、样品的生长和提取步骤、样品标记、杂交，扫描、分析步骤等）；③ 提交芯片设计（ 名称、设计、技术等） ； ④ 提交实验 （ 实验设计、发表的论文、样品、提取物等）。有关的详细信息请参阅网页： http ://www . ebi. ac. uk/ miamexpress/ Help。
3.15 统计模型
剩余最大似然法（REML 法） [ 27 ] 在 GenStat 第 7 版 （ 2003年）统计系统中应用 ，适合于混合模型（ 包括随机和固定效应），以从任何特定比较（ 如 14dpa 的 B102-1-1与 L88-31 ) 中，每个基因多达 6 个观察值，建立一套完整的数据集。根据模型偏差估算实验设计中由生物学重复和技术重复所组成的方差，不同的模型之间进行测试时，随自由度变化的其方差变化服从 x2 分布。使用 Wald 检验 [ 28 ] 评估模型中的固定效应，测试统计量也服从 x2 分布。因此，建模考虑了设计上的变异效应（ 随机效应）和固定效应 （ 9246 个基因）。经过随机和固定参数（term) 的显著性评估，在 14dpa 的 B 102-1-1 和 L 88-31 比较模型是：
来源：丁香实验
