【原创】真核表达His蛋白，进行天然构象蛋白纯化的心得和疑问。

由于要做酶活性实验，所以选择真核表达His标签蛋白进行非变形的纯化。（避免了原核表达可能得到没功能的蛋白。）先上图上真相：


这个说明了：细胞超声裂解后，离心沉淀的碎片里含少量His标签的过表达目的蛋白（第一道），上清里含大量His蛋白（第二道）。之后用特殊的含有镍的树脂小球纯化His蛋白，由于裂解液体积太大了，就分了两次加到柱子里。

第一次加进去之后4度孵育1h，然后弃流出液（第三道），第二次把剩下的裂解液加进去，同样4度孵育1h后弃流出液（第四道）然后用漂洗液洗2次柱子里的树脂，使得非特异性黏着的蛋白都掉下来。

（第五道和第六道）最后，用洗脱液把His蛋白从树脂上洗下来（第七道）（感觉整个过程有点类似于质粒抽提。）

然后，先说有用的：罗氏的树脂太TMD赞了。。据它自己说工作PH在3-10几，并且不掉Ni，不用recharge，省时省力，如果用500mM的咪唑洗脱之后，都不用清洗柱子就可以很干净。。据它自己说，wash buffer上一次就可以洗的相对比较干净。

我以前用的某个C开头的米国货，纯化的我要死要活的。费N多时间在recharge、wash上，为了干净还得使用梯度洗脱，累个半死，蛋白产量时有时无！罗氏这家伙的东东果然NB，我做了6个全部都有货。嘿嘿。

货含量还不错，并且纯化用的时间短多了，更不用梯度洗脱（这个据它自己说绝对不可以嗷，呀卖呆，因为它说它在20mM咪唑下就能把蛋白踹出来了。）另外，his抗体我用的是艾美捷的mouse anti his，这个稀释比很高，1:5K还这么NB。。推荐。

再说一下问题，这个对我很关键，关系到我干活的效率和频率，希望觉得上面说得有用的大虾们指点迷津！

第一，我用了0.5ml的树脂（内含50%体积的干货，50%体积乙醇溶液），裂解液是7ml=7盘10cm的转染HEK。我想知道，裂解液流出去之后为毛有N多his蛋白没结合上？

请选择：

A）蛋白量太大树脂太少

B）由于过表达导致His形成包涵体流出来了

C）孵育时间不够长或者温度不够高

D）pH我控制的不好，我用的7.5-8左右，偏碱性。

选A的童鞋要告诉我，一盘子的HEK大约能产生多少ug的重组蛋白？！！这个很重要，据罗氏哼哼它能结合40mg蛋白/ml树脂；选B的童鞋告诉我，真核过表达做纯化需要注意神马；选C的童鞋说说，孵育时间多长或者神马温度结合效率会比较高，求经验；选D的童鞋详细说说等电点怎么算，酸碱性对蛋白稳定性、构象和溶解性有神马影响？！

如果有大虾回答得详细且有道理，我过几天就把银染之类的图丢上来，给大家看一下这个树脂纯化出来的纯度怎么样。。现在我也不知道纯度怎么样。。额。。。打了这么多的字，有莫有精华？