天然蛋白纯化思路解析

天然蛋白的特性可以说是迥然有异，每种蛋白都是不一样的烟火，共同特点就是丰度很低，自带丰富的背景杂质，并且没有特异性的纯化方法可循。

然万物皆有共性，我们只需找到他们的共同点就可以求同存异，一切难题也就可以迎刃而解。凡是蛋白质都是氨基酸组成的，氨基酸既是两性电离物质又有多种多样的R 取代基，那么丰富的氨基酸组成就让不同蛋白质或多或少拥有带电性与疏水性。

图1. 蛋白质结构示意图

以上给我们的纯化提供了基础方案：以离子交换层析和疏水层析为核心步骤来开展。由于天然蛋白的复杂性，通常一步简单纯化很难达到我们的需求。

事业已经成功了一半，另一半主要考验策略。成功有效纯化蛋白质的关键除了选择适宜的纯化技术，还要通过优化实验参数来达到要求的纯度，并且将各个纯化步骤以最合理的方式衔接起来，使用最少的纯化步骤，最少的劳动力，最经济的方案，达到蛋白质产量的最大化。

图2. 蛋白质纯化技术流程图

晋级之门已经开启，你的老板对你提出了三次公演的挑战！本攻略来教你如何乘风破浪。

1、根据样品的初始条件选择离子交换或者疏水层析。如果样品初始处于低盐的缓冲液（中脱盐或缓冲液置换），就可以预判纯化使用的 pH 值，并选择离子交换层析进行第一步捕获。如果样品初始处在高盐缓冲液（硫酸铵沉淀），就可以调整样品的初始电导率，选择疏水层析进行初步捕获。

2、根据离子交换和疏水层析的洗脱特点，样品洗脱的缓冲液不同，进行合理衔接中度纯化。通常将离子交换和疏水层析交叉使用，不仅可以让样品在不同维度进行纯化，还可以节省衔接实验的处理过程。

3、复杂难纯的天然蛋白，可以再加一步精细纯化。凝胶过滤分子筛是较优选择，原因其一是当带电性和疏水性两个维度都无法分离的杂质，还可以用分子量这个维度来处理。其二是凝胶过滤层析对样品的缓冲液条件没有太多要求，任何层析都可以无缝衔接。

 

我们来看个具体晋级路线帮助增强自信。从微生物提取胰凝乳蛋白酶α-chymotrypsin。

α-Chymotrypsin 属于丝氨酸蛋白酶的一种，在酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的羧基处水解肽键。

表1. α-Chymotrypsin参数和对纯化设计影响表

 

样品前处理使用超声方法进行菌体破碎，然后提取胞内总蛋白至合适 pH 值的缓冲液中，蛋白酶较不稳定，应同时考虑纯度和蛋白回收率之间的平衡关系。

图3. 样品处理流程图

 

 

纯化策略设计为：

1. pl 较高的蛋白首先使用 Capto S 进行阳离子交换粗纯，由于大部分宿主蛋白杂质带负电，会从阳离子柱上流穿，因此 Capto S 可以除掉绝大多数的背景蛋白。
2. 然后使用 Superdex 75 10/300 GL分子筛进行精细纯化，此步可以去聚集体或痕量小分子杂质，至此就可以得到较纯的天然蛋白组分了。

 

Capto 系列的离子交换和疏水填料都拥有高动态载量，高流速，高化学耐受性的特点，可以在更短的时间完成更高处理量的纯化实验，时间和经济成本都可节省。

相信你已经get 到了天然蛋白纯化的精髓，今后做任何蛋白的纯化都可以所向披靡了！