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蛋白纯化

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dxy_hk929ug2

蛋白纯化,Western Blot检测有his标签,但是大多数目的蛋白挂不上柱子,是什么原因呢

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3 个回答

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飞跃迷雾1

有帮助

His蛋白纯化不挂柱可能是存在以下问题:

1.Ni柱本身的问题,建议重新装柱子,以确保Ni柱的效率。2.既然不加咪唑,蛋白的结合也存在问题,那么就要考虑降低盐浓度。3.还有一点就是从破菌到Ni柱上样,不能还有EDTA。4.最坏的就是你的蛋白质在折叠的过程中将C端的His-tag包埋了,这样的话,你就要重新构建了。

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huarenqiang5

有帮助

考虑以下几点原因及建议:

1.纯化工艺不利于结合作用发挥。

2.. 蛋白不稳定,标签掉落。

3.由于标签被包裹在蛋白结构内部导致目的蛋白不能挂柱,验证方法是给样品里加上尿素或盐酸胍变性,然后再变性条件纯化,看目的物是否能挂柱。

4.标签表达问题,做weatern blot,用标签的抗体检测组氨酸是否被表达,挑到突变株未表达标签也会发生目的物不挂住的情况,这样的话需要重新构建克隆。

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loveliufudan

有帮助

原因可能有:

1. 目标蛋白表达量太低,超过柱子的结合容量。可以优化诱导条件,提高表达量。

2. 目标蛋白折叠不正确,His 标签被包埋在内部而难以接触。优化重组蛋白的表达条件。

3. His 标签接入目标蛋白的位置不佳,影响了亲和性。可以重新设计表达载体的克隆位点。

4. 洗脱条件强度过高,洗脱了大部分蛋白。可以调低咪唑浓度,甚至不加咪唑洗脱。

5. 目标蛋白与其他蛋白形成复合体,间接影响了结合。可以变性处理样本试试。

6. Ni 柱的结合能力问题,可更换不同批号甚至品牌的 Ni 柱进行试验。

需要从提高表达量、优化标签接入、调整洗脱条件等方面进行多方面测试与优化,才能提高目标蛋白的结合率。

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