用于免疫印迹的细胞裂解液的制备

通常需对不同样品抗原的总量进行比较或确定样品中是否存在待测抗原。在此过程中，细胞、组织或其他样品均直接用样品缓冲液破碎，当样品中的染色体DNA被剪切成短片段后，经适当处理即可用于特定的电泳系统。在本例中，样品是以适合于标准的Tris／GlycineSDS-PAGE方式制备的。

某些样品需经剪切处理染色体DNA降低其溶液黏度，最简便的方法是超声处理，用浸入式探头或杯型超声器均可。

1．对照

免疫印迹从细胞裂解液开始就须设置两组对照。包括含有已知抗原的阳性对照样品和能与阴性对照抗体发生反应的细胞裂解物。

阳性对照是含有已知的或标准量的待测抗原样品，来源于细菌或杆状病毒超常表达系统或已鉴定的细胞系。它可提示免疫印迹是否成功，并能对抗原的相对分子量进行精确比较；如果阳性对照中抗原的量是已知的，可粗略估计出待测样品中抗原的含量。

阴性对照给出的是非免疫抗体与待测样品的背景读数。若有可能，再设置一个不含待测抗原的细胞裂解液对照(例如来源于含无效基因的细胞)更利于解释结果。

若比较多个不同细胞样品的抗原含量，则需考虑样品标化问题。例如，若进行有意义的比较，需校正样品的总蛋白量，或校正细胞数。测定样品中蛋白质浓度可用蛋白质定量的常用测定方法。样品中若未加溴酚蓝，蛋白质较易定量。并可节省样品缓冲液。

2．准备工作

准备1个70 ℃水浴箱。

3．需要的溶液

不含DTT的Laemmli样品缓冲液(20％SDS、10％甘油，60mmol／LTris，pH 6．8和0．01％溴酚蓝)；
lm01／LDTT(—20 ℃贮存)。

4．特殊设备

若选用酵母或细菌，则需一台超声装置

5．操作步骤

(1)确定需进行裂解的样品体积。组织培养细胞(10’细胞)为1 g加l ml裂解液。称取足够量的组织或器官样品，1 s加lml裂解液。将细菌或酵母细胞离心沉淀，通过与刻度试管比较，按其沉淀物体积加入裂解液。

(2)加入10倍体积的样品缓冲液，强力混匀。用于Tris／GlycineSDS—PAGE的1X样品缓冲液为：2％SDS、100 mmol／LDTT(取自—20 ℃存放的lmol／L贮存液，临用前加入)、60 mm01／LTris(pH 6．8)、0．01％溴酚蓝和10％甘油。

(3)对于酵母或细菌，用超声装置裂解细胞。用样品缓冲液悬浮细胞，以最大的强度超声4次，每次15～30s。在每次超声步骤之间，将样品转置冰浴中15s。

(4)样品置70 ℃水浴加热至少5min。

(5)10 000 g离心10rain，取上清液，将其移入另一洁净试管中。

至此，电泳样品已准备就绪。

样品既可立即使用也可冻存。—20 °C存放的样品可稳定保持数月。