实时定量PCR探针的合成
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实时定量PCR (qPCR)的优势:
· 实时检测PCR反应过程
· 精确计算出每个循环的PCR产物量
· 扩增和检测同时进行
· 消除后续PCR的干扰
在实时定量PCR反应中，杂交探针与插入染料如SYBR Green相比是更好的选择。荧光标记探针可以提高实时定量PCR结果的效率、灵敏度和特异性。而且定量PCR可以在一个反应里同时检测多个目标基因。
实时定量PCR的应用:
· 基因表达分析
· 转基因检测和定量
· 病原体检测和定量
· 基因型/ SNP分析
· 突变检测
多重PCR分析的优点:
· 省钱省时省力
· 所需样品量少
· 消除移液误差
· 可以在一个反应里设置内部对照
· 便于筛选
双标探针的原理:
PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；PCR 扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的5' －3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。
荧光共振能量转移(FRET)技术的原理:
两条线性寡核苷酸探针，其中一条的3 ‘端标记荧光激发基团，另一条的5 ' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。
分子信标的原理:
分子信标技术是在同一探针的两末端分别标记荧光基团和淬灭基团，为一种标记荧光的发夹探针。在未与模板发生杂交前该探针分子呈发夹结构，结合在其两端的荧光基团距离上接近，产生能量转移效应，不发生荧光。当该探针与模板杂交，使荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。
下表列出的是最常用的荧光基团及与之匹配的淬灭基团
| Spectral Properties Table | ||||||
| Dye | Color |
Max. EX (nm) |
Max. EM (nm) |
Compatible Quencher |
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| 6-FAM | Green | 492 | 515 | BHQ-1, TAMRA | ||
| JOE | Orange | 520 | 548 | BHQ-1, TAMRA | ||
| TET | Orange | 521 | 536 | BHQ-1, TAMRA | ||
| HEX | Pink | 535 | 556 | BHQ-1, TAMRA | ||
| TAMRA | Rose | 556 | 580 | BHQ-2 | ||
| Cy3 | Red | 552 | 570 | BHQ-2 | ||
| ROX | Red | 587 | 607 | BHQ-2 | ||
| Cy5 | Violet | 643 | 667 | BHQ-3 | ||
由于NED，VIC，PET等荧光素的专利归Perkin Elmer公司所有，所以我们推荐以下可替代的荧光素：
实验中常用的淬灭基团:
使用无荧光的淬灭基团可以提高实时定量PCR、多重PCR、FRET实验中的灵敏度。
Dabcyl – Dark Quencher 400–550 nm
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分子信标推荐使用Dabcyl淬灭基团。它在抑制蓝色至绿色发射光谱的各种荧光染料时非常有效，但是不适合淬灭发射光谱大于480nm的荧光素。 淬灭范围：400-550 nm 最大吸光值：453 nm 摩尔消光系数：32.000 M−1 cm−1 分子量：399.2 g/mol |
BHQ1 – Dark Quencher 480-580 nm
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BHQ1是Biosearch Technologies公司的黑洞淬灭基团之一，对于双标探针、分子信标和FRET探针非常有效，对绿色至黑色发射光谱中的所有染料都有极好的光谱重叠效应。 淬灭范围: 480-580 nm 最大吸光值: 534 nm 摩尔消光系数: 34.000 M−1 cm−1 分子量: 491.5 g/mol |
BHQ2 – Dark Quencher 520-650 nm
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BHQ2 是Biosearch Technologies 公司的第二个黑洞淬灭基团。BHQ2能高效应用于5’端带荧光的双标探针、分子信标和FRET探针，有效发射光谱是由深绿色至橙色。 淬灭范围：520-600 nm 最大吸光值：544 nm 摩尔消光系数91.000 M−1 cm−1 分子量：493.5 g/mol |
TAMRA – Fluorescent Quencher 520-600 nm
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TAMRA (Tetramethylrhodamin)是一种可以用作双标探针及分子信标的3’端和内部淬灭基团（TAMRA-dT）的荧光染料。它的淬灭范围适合5’端的报告基团，如FAM, HEX, TET, JOE, Yakima Yellow, Cy3 或者其他这个波长范围内的染料。在多重PCR中不推荐使用TAMRA，因为它的荧光特性将使淬灭基团和报告基团光谱发生重叠，增加背景干扰。 淬灭范围: 520-600 nm 最大吸光值: 544nm 摩尔消光系数: 91.000 M−1 cm−1 分子量: 612.7 g/mol |
双标探针和5’核酸酶试验引物的设计准则：
双标探针(荧光淬灭探针或称FQ探针) 在其5’端和3’端分别有一个荧光报告和淬灭基团。利用Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性，这些探针可以用于定量PCR体系。靶序列的特异性探针和特异性的PCR引物同时使用，设计的该探针在上下游PCR引物的范围内退火。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性将荧光报告基团从探针上切割下来。随着PCR循环数的增加，游离报告基团的数量不断的增加，实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号，从而对靶序列进行定量分析。
在设计这些双标探针的时候需要谨记以下几个要点。
1. 探针的结合位置很重要，先设计好探针再设计PCR引物。
2. 探针的结合位点应该靠近扩增产物的中心，扩增产物的长度应该在50-150bp之间。
3. 探针的解链温度应该在68℃至70℃之间。
4. 探针的长度最少20bp，否则容易发生非特异性结合。
5. 尽量避免在探针的5’端出现dG ，因为dG 是一个较弱的淬灭剂，任何dG 都要离5’端至少两个碱基。
探针的设计标准：
G-C 含量:：30~80%
多聚碱基:：避免出现多个重复碱基，特别是4个或者多于4个G。
末端构成:：在末端不能出现G。
退火温度:：68-70℃
DNA链：挑选C多余G的链。如果使用互补链，确保C不存在于3’端。
长度:：少于30个碱基。
设计：淬灭基团在3’端，荧光染料在5’端。
引物的设计标准：
G-C含量: 30-80%
多聚碱基: 避免出现多个重复碱基，特别是4个或者多于4个G
末端组成: 3’端的5个碱基中不能多于两个G或者C，建议A出现在3’端，便于引物二聚体更加高效的降解。
退火温度:：58-60℃
产物: 50-150 个碱基
设计: 在设计完探针之后再设计引物，尽量紧靠探针但是不要发生重叠。其中的一条引物可以和外显子交接，用于扩增mRNA。
分子信标的设计原则：
分子信标的5’端和3’端也分别有一个荧光报告基团和一个淬灭基团。当荧光染料和淬灭基团接近的时候，探针会形成一个发夹结构。在PCR中，分子信标是特别针对目的基因设计的，分子信标探针可以使PCR引物退火。在PCR的退火阶段，探针和它对应的靶序列杂交，发夹环解开后，荧光报告基团和淬灭基团分离，可以发出一个荧光信号。信号的强弱和靶序列的多少成正比，通过实时监测这个信号，可以对靶序列进行定量。为了精确检测PCR过程，分子信标必须和它们的靶序列在退火阶段杂交成功，而游离的分子信标应该继续保持封闭状态，不会发出任何荧光。通过适当选择探针的长度和靶序列的长度，当温度高于退火温度7-10℃时，探针能够从靶序列上脱离下来，这样的探针序列的长度就很适宜。探针与靶序列的解链温度可以用“GC百分比”原则预测，很多设计探针的软件包都使用这个原则。在添加茎环区序列之前，这个预测方法只能用在探针序列的设计上。实际应用中，探针序列的长度范围通常是15-30个核苷酸。
上图显示的是分子信标在实时定量PCR中的应用原理
A: 不和靶序列结合的时候，分子信标呈现发夹结构。荧光报告基团和淬灭基团的紧密结合阻止了报告基团释放荧光。B:在PCR的退火阶段，分子信标和靶序列杂交结合，将荧光染料和淬灭基团分离，导致荧光染料释放信号。信号的强弱和靶序列的多少成正比，实时监测荧光信号可以对靶序列进行定量。
· 茎环区的解链温度比退火温度高7~10℃
· 探针的环状区需要15~30碱基
· 茎环区的两边长度应该在5~7 碱基之间
· 扩增产物的长度少于150 bp
北京赛百盛基因技术有限公司对每条探针都免费提供质谱(MS)分析图
| 名称 | 2 OD | 5 OD | 10 OD |
| Taqman probes with Black Hole Quencher | 元/条 | 元/条 | 元/条 |
| 5' -FAM and 3'- BHQ-1 | 600 | 700 | 900 |
| 5'- HEX and 3'-BHQ-1 | 750 | 900 | 1200 |
| 5' -TET and 3' –BHQ-1 | 750 | 900 | 1200 |
| 5' -Cy3 and 3' –BHQ-2 | 1000 | 1300 | 1900 |
| 5' -Cy5 and 3' –BHQ-3 | 1000 | 1300 | 1900 |
| 5' -TAMRA and 3' –BHQ-2 | 650 | 800 | 1100 |
| Taqman probes with TAMRA Quencher | 元/条 | 元/条 | 元/条 |
| 5' -FAM and 3' -TAMRA | 500 | 600 | 800 |
| 5' -HEX and 3' -TAMRA | 650 | 800 | 1100 |
| 5' -TET and 3' -TAMRA | 650 | 800 | 1100 |
| Molecular Beacon | 元/条 | 元/条 | 元/条 |
| 5' -FAM and 3' -Dabcyl | 500 | 600 | 800 |
| 5' -HEX and 3' -Dabcyl | 650 | 800 | 1100 |
| 5' -TET and 3' -Dabcyl | 650 | 800 | 1100 |
| 5' -Cy3 and 3' -Dabcyl | 900 | 1200 | 1700 |
| 5' -Cy5 and 3' -Dabcyl | 900 | 1200 | 1700 |
| 5' -TAMRA and 3' -Dabcyl | 600 | 700 | 900 |
● 探针的长度在35个碱基以内，碱基合成不再另收费
● PAGE 或HPLC 纯化
● PAGE和MS质检
● 3-4个工作日出货
